/2010)病毒的 ELISA试剂盒。
[0039] 本发明所提供的检测口蹄疫0型（0/Mya98/BY/2010)病毒的化ISA试剂盒，包括 用lF2anti作为包被抗体包被的微孔板和用lF2anti作为酶标抗体的酶标记抗体工作液。
[0040] 所述用lF2anti作为包被抗体包被的微孔板指的是用IOmM抑7. 0-7. 4PBS将 lF2anti稀释成0. 5-10yg/mU加入微孔板中，110y1/孔，置于2-8°C过夜；拍干后，加入含 1%BSA的IOmM抑7. 0-7. 4PBS，300y1/孔，置于2-8°C过夜；拍干、干燥后真空装入侣锥袋 中备用。
[0041] 所述酶标抗体可用辣根过氧化物酶（HR巧或碱性憐酸醋酶（AL巧等标记酶标记抗 体，然后用酶标记抗体稀释液（配方为：化2册〇4?12&02. 9g，胞&口〇4?2&0 0.296g，化Cl 8. Sg, Proclin 3000. 6血，BSA IOg,胎牛血清150血，酶稳定剂5g，Tween-200. 25血，用双蒸 水定溶至1000血，调整抑值至7. 6-7. 8)稀释成工作液，工作液的浓度为0. 1-1. 0 y g/mL。
[0042] 所述试剂盒还可包括显色液A液、显色液B液和终止液，所述显色液A液为过氧化 氨或过氧化脈溶液，所述显色液B液为邻苯二胺或四甲基联苯胺溶液，所述终止液为H2SO4 溶液。
[0043] 此外，为方便检测，所述试剂盒还可包括：稀释液，如抑7. 0-7. 410mMPBS缓冲溶 液；洗涂液，如PBST等常规的洗涂试剂。
[0044] 为便于观测结果，所述试剂盒还可包括标准口蹄疫0型（0/Mya98/BY/2010)病毒 阳性血清（阳性对照）和标准口蹄疫0型（0/Mya98/BY/2010)病毒阴性血清（阴性对照）， 可用稀释液作为阴性对照使用。
[0045] 本发明的第四个目的是提供一种检测口蹄疫0型（0/Mya98/BY/2010)病毒的金标 纸层析试纸条或测试卡。
[0046] 用于检测口蹄疫0型（0/Mya98/BY/2010)病毒的金标纸层析试纸由玻璃纤维膜样 品垫、结合物释放垫、吸水垫、硝酸纤维素膜（NC膜）组成，硝酸纤维素膜上设有检测线灯 线）和质控线（C线）。
[0047] 金标纸层析试纸的制备方法包括W下步骤：
[0048] 1)包被硝酸纤维素膜（NC膜）
[0049] 用浓度为l-5mg/mL的单克隆抗体lF2anti包被检测线灯线）；用浓度为l-5mg/ mL的羊抗鼠免疫球蛋白（购自北京博尔西科技有限公司）包被质控线（C线）；用BIODOT公 司XYZ3000喷膜机将单克隆抗体lF2anti和羊抗鼠免疫球蛋白分别喷于300mm长、25mm宽 的硝酸纤维素膜上，形成相互分离的检测线和质控线，检测线和质控线间距为0. 3-1.Ocm, 通常选择0. 5畑1。37°C干燥1小时后备用。
[0050] 2)结合物释放垫的制备
[0051] 2. 1用胶体金标记单克隆抗体lF2anti，方法为：在磁力揽拌下，向=角瓶中加入 155mL纯化水，煮沸。加入1 %四氯化金溶液5mU煮沸。再加入1 %巧樣酸S钢溶液7mU煮 沸5分钟。冷却后保存于2-8°C。取1毫升胶体金溶液于离屯、管中。加入15yl0.2M碳酸 钟溶液，室溫静止5min。加入10y1抗体，混匀后静置30min。加入10y1 20%BSA溶液，平 衡5min。加入10y1 20%阳G20000溶液，平衡30min;用离屯、机10000巧m，离屯、lOmin，去 上清液。加入IOOyl金标复溶液（含有2%薦糖、1 %酪蛋白、0.5%BSA、0.ITritonX100、 0. 1 %SDS的棚酸缓冲液），复溶后备用。
[0052] 2. 2制备结合物释放垫：结合物释放垫的材质为玻璃纤维膜，其上包被有胶体金 标记的特异性单克隆抗体lF2anti，将复溶后的金子1:4稀释后按照8yVcm的速度喷膜， 37 °C下放置2小时干燥，备用。
[0053] 3)制备金标纸层析试纸
[0054] 在PVC背板上先黏贴硝酸纤维素膜，在靠近硝酸纤维素膜质控线的一端黏贴吸水 垫，在靠近测试线一端黏贴结合物释放垫和样品垫，得到用于检测口蹄疫0型（〇/Mya98/ BY/2010)病毒金标纸层析试纸，然后可按所需大小进行切割，得到用于检测口蹄疫0型（0/ Mya98/BY/2010)病毒金标纸层析测试条，加干燥剂后密封保存。
[0055] 如将上述步骤制备的测试条装入塑料卡中，制成测试卡，并组装成试剂盒，该试剂 盒对应于样品垫的部位设有点样口，对应于检测线和质控线的部位设有观测窗。
[0056] 本发明使用可W诱发机体产生免疫反应的口蹄疫0型（0/Mya98/BY/2010)病毒作 为免疫原，采用常规杂交瘤技术经过细胞融合并筛选得到能持续、稳定分泌抗口蹄疫0型 (0/Mya98/BY/2010)病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞株1F2,并由该细胞株分泌得到单克 隆抗体lF2anti。本发明的单克隆抗体能够特异性地识别口蹄疫0型（0/Mya98/BY/2010) 病毒，可用于检测口蹄疫0型（0/Mya98/BY/2010)病毒，并具有高特异性、高灵敏度的优点。 实验证明，本发明的单克隆抗体可W准确检测样品中口蹄疫0型（0/Mya98/BY/2010)病毒 的水平，而不与口蹄疫0型（0/GX/09-7)、亚洲1型（J化/06)、A型巧e-A/WH/09)病毒发生 交叉反应。本发明将在口蹄疫0型（0/Mya98/BY/2010)病毒的检测、疫苗生产、流行病学研 究中发挥重要作用，应用前景广阔。
[0057] 下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
【附图说明】
[0058] 图1为抗口蹄疫0型（0/Mya98/BY/2010)病毒的单克隆抗体lF2anti纯度8%的 SDS-PAGE电泳检测结果；
[0059] 图2为抗口蹄疫0型（0/Mya98/BY/2010)病毒的单克隆抗体lF2anti构象型表位 的WesternBlot检测结果；
[0060] 图3为抗口蹄疫0型（0/Mya98/BY/2010)病毒的单克隆抗体lF2anti的亚型鉴定 结果；
[0061] 图4为用单克隆抗体lF2anti及ELISA双抗体夹心法检测口蹄疫0型（0/Mya98/ BY/2010)病毒的灵敏度的拟合曲线；
[0062] 图5为胶体金纸层析试纸条正面结构图；
[0063] 图6为胶体金试纸条组装示意图；
[0064] 图7为用单克隆抗体lF2anti制备的金标纸层析试纸盒检测口蹄疫0型（0/ Mya98/BY/2010)病毒的灵敏度检测结果。
【具体实施方式】
[0065] 下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见： 《MolecularCloning:ALaboratoryManual》（Sambrook，J.，Russell,DavidW.,Molecular Cloning:ALaboratoryManual，3rdedition，2001，NY，ColdSpringHarbor)。
[0066] 所述百分比浓度如无特别说明均为质量/质量（W/W，单位g/lOOg)百分比浓度、 质量/体积（W/V，单位g/lOOmL)百分比浓度或体积/体积（V/V，单位mL/lOOmL)百分比浓 度。
[0067] 实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径W达 到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的 来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可W按照实施例中的提 示替换使用。
[0068] 实施例在W本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的 操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。
[0069] 实施例1、获得持续、稳定分泌抗口蹄疫0型（0/Mya98/BY/2010)病毒的单克隆抗 体的杂交瘤细胞
[0070] 杂交瘤细胞株1F2的获得方法，包括W下步骤：
[0071] 1、动物免疫
[0072] 1)基础免疫：W口蹄疫（0/Mya98/BY/2010)病毒（由金宇保灵生物药品有限公司 提供）作为免疫原，采用薦糖密度梯度离心法测定，纯度> 85%，浓度为10-1000yg/血。必 要时，可用超滤管浓缩病毒抗原W提高病毒含量，浓缩后抗原与福氏完全佐剂（购于Sigma 公司）等体积混合并充分乳化，多点皮下注射乳化液，每只Ba化/c小鼠（8-12周龄，雌性， SPF级动物培养，购自军事医学科学院实验动物中屯、）每次注射量为150yg。
[0073] 2)加强免疫：将浓缩后抗原与福氏不完全佐剂（购于Sigma公司）等体积混合并 充分乳化，多点皮下注射乳化液，每只Ba化/c小鼠每次注射量为200yg。在进行细胞融合 前3天，腹腔注射含200yg抗原的生理盐水溶液，W进一步增强免疫效果。
[0074] 2、杂交瘤细胞的制备和筛选
[0075] 用常规方法收集小鼠的脾细胞，将脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0细胞按10:1的 比例在500g/LPEG4000 (融合剂，购于Sigma公司）的诱导下进行融合。用HAT(购自生兴 生物技术（南京）有限公司）选择性培养液培养，培养条件为5%二氧化碳、37°C。融合后 10-15天，取上清采用间接化ISA法筛选分泌抗口蹄疫0型（0/Mya98/BY/2010)病毒的杂交 瘤细胞株，间接化ISA法的操作步骤为：用110yL浓度为4yg/mL的口蹄疫0型（0/Mya98/ BY/2010)病毒包板，拍干后，用1%BSA封闭液（100血pH7. 410mMPBS中加入IgBSA，BSA 购于Sigma公司）封闭，W免疫小鼠血清1:2000,无克隆生长的培养基上清和正常小鼠血清 作为阴性对照，每孔加1:2000HRP-山羊抗小鼠IgG(购自美国ABCAM公司）