amp;口〇4? 2&0，0. 296g;化Cl, 8. 5g;Proclin 300,0. 6血；BSA，IOg;胎牛血清，150血；酶稳定剂，5g;Tween-20 0. 25血；双蒸水，定溶至 1000血；调整抑至7. 6-7. 8。
[0137] 4)向微孔板中分别加入口蹄疫0型（0/GX/09-7)病毒梯度稀释液IOOiiL/孔，病 毒浓度见表4, 37°C溫育1小时； 阳13引5)用PBST洗液（配方：胞2册〇4?12&0 58g，化&?〇4?2&0 5. 92g，NaCl170邑，Tween-20 5.0血，Proclin300 0.6血，用双蒸水定溶至1000血，调整抑值至7. 2-7. 4;使用 前用双蒸水稀释20倍）洗板5次后，再加入抓Santi-HRP(1:1000-1:8000稀释）100yL/ 孔，37°C溫育0.5小时；
[0139] 6)用PBST洗板5次后加入显色液A(配方为：无水乙酸钢4. 5g，冰醋酸 1. 2血，过氧化脈0. 8g，用双蒸水定溶至1000血。）、显色液B(配方为：巧樣酸1. 62邑， 邸TA-2化0. 372g，甘油100血，四甲基联苯胺盐酸盐0. 50g，用双蒸水定溶至1000血。）各 50yL/孔进行显色，37°C溫育15min; 阳140] 7)加入终止液（配方为aOOOmL双蒸水中含有98%的硫酸27. 8mL。），50iiL/孔， 读数〇〇4加。 阳141] 检测结果如表4所示，可W看出该抓6anti(包被）-抓6anti(标记）配对试剂盒 能够检测1. 875-60ng/mL范围的抗原，在该区间内线性满足需要，表明该试剂盒具有良好 的线性，且灵敏度很高。 阳1伯]表4用单克隆抗体抓6anti及化ISA双抗体夹屯、两步法检测口蹄疫0型（0/GX/09-7)病毒的结果 阳 143]
[0144] 2、W抓6anti为包被抗体W2H10anti为标记抗体检测不同浓度的口蹄疫O型（0/ GX/09-7)病毒--6D6anti(包被）-2H10anti(柄;记）配对试剂盒
[0145]W特异性抓6anti为包被抗体；W非特异性2H10anti为标记抗体，采用下述方法 同样也可W实现特异性检测目标抗原的目的。检测方法包括W下步骤：
[0146] 1)将单克隆抗体抓6anti用抑7. 0-7.4IOmMPBS缓冲溶液稀释成4yg/mU想 微孔板的每孔加IiOy^ 4°C下包被过夜；
[0147] 2)倾去包被液，拍干，然后在每孔中加入300yL1%BSA(在抑7. 0-7. 4IOmM PBS缓冲溶液中），放入4°C封闭过夜后，拍干、干燥，保存；
[0148] 3)采用过舰酸钢法和辣根过氧化物酶（HR巧标记单克隆抗体2H10anti，得到 2H10anti-HRP，用酶标记抗体稀释液按照一定比例稀释成工作液备用。HRP酶标记方法具 体为：
[0149] 称取3mgHRP溶解于1血蒸馈水中。于上液中加入0. 12血新配的0.IM化1〇4溶 液，室溫下避光揽拌20分钟。将上述溶液装入透析袋中，对ImMpH4. 4的醋酸钢缓冲液透 析，4°C过夜。加30y1 0. 2MpH9. 5碳酸盐缓冲液，使透析后的HRP的抑升高到9. 0-9. 5， 然后立即加入溶解在1血0.OlM碳酸盐缓冲液中的4mgIgG,室溫避光轻轻揽拌2小时。 加0. 12血新配的5mg/mLNaBH4溶液，混匀，再置4°C2小时。将上述溶液装入透析袋中， 对0.OlMpH7. 2PBS透析，4°C过夜。取出后加入等体积优质甘油，分装，-20°C保存，即为 1F2-HRP。用酶标记抗体稀释液按照一定比例稀释即为酶标记抗体工作液。酶标记抗体稀释 液的配方为：化2册〇4.12&0,2. 9g;胞&口〇4.2&0,0. 296g;化Cl，8. 5g;Proclin300,0. 6血； BSA，IOg;胎牛血清，150血；酶稳定剂，5g;Tween-20 0. 25血；双蒸水，定溶至1000血；调整 抑至 7. 6-7. 8。
[0150] 4)向微孔板中分别加入口蹄疫0型（0/GX/09-7)病毒梯度稀释液IOOiiL/孔，病 毒浓度见表4, 37°C溫育1小时；
[0151] 5)用PBST洗液（配方：胞2册〇4?12&0 58g，化&?〇4?2&0 5. 92g，NaCl170邑， Tween-20 5.0血，Proclin300 0.6血，用双蒸水定溶至1000血，调整抑值至7. 2-7. 4;使用 前用双蒸水稀释20倍）洗板5次后，再加入2H10anti(1:1000-1:8000稀释）100yL/孔， 37°C溫育0. 5小时； 阳152] 6)用PBST洗板5次后加入显色液A(配方为：无水乙酸钢4. 5g，冰醋酸 1. 2血，过氧化脈0. 8g，用双蒸水定溶至1000血。）、显色液B(配方为：巧樣酸1. 62邑， 邸TA-2化0. 372g，甘油100血，四甲基联苯胺盐酸盐0. 50g，用双蒸水定溶至1000血。）各 50yL/孔进行显色，37°C溫育15min;
[0153] 7)加入终止液（配方为：1000血双蒸水中含有98%的硫酸27. 8血)，50yL/孔， 读数〇〇4加。
[0154] 检测结果如表5所示，可W看出抓6anti(包被）-2H10anti(标记）配对试剂盒能 够检测1.875-60ng/mL范围的抗原，在该区间内线性满足需要，表明该试剂盒具有良好的 线性，且灵敏度很高。 阳巧日]表5用单克隆抗体抓6anti、2化O及化ISA双抗体夹屯、两步法检测口蹄疫O型（0/GX/09-7)病毒的结果
阳157] 二、用单克隆抗体抓6anti、2化Oanti及化ISA双抗体夹屯、法检测不同浓度的口蹄 疫0型（0/GX/09-7)病毒，W确定检测方法的灵敏度，检测方法与步骤一相同
[0158] W抓6anti既为包被抗体又为标记抗体（即抓6anti(包被）-抓6anti(标记）配 对试剂盒）检测不同浓度口蹄疫0型（0/GX/09-7)病毒的检测结果如表4所示，该检测中 拟合曲线如图4(横坐标表示W10为底的浓度的对数，纵坐标表示W10为底的OD值的对 数）左侧A幅所示，可W看出线性相关系数> 0. 99,检测灵敏度可达1. 875ng/mU此时OD 值为阴性对照的2倍。表明该抗体组合成的试剂盒具有良好的灵敏度。
[0159] W抓6anti为包被抗体W2H10anti为标记抗体（即抓6anti(包被）-2H10anti(标 记）配对试剂盒）检测不同浓度口蹄疫0型（0/GX/09-7)病毒的检测结果如表5所示，该 检测中拟合曲线如图4(横坐标表示W10为底的浓度的对数，纵坐标表示W10为底的OD 值的对数）右侧B幅所示，可W看出线性相关系数> 0. 99,检测灵敏度也不超过1. 875ng/ mU此时OD值为阴性对照的2倍。表明该抗体组合成的试剂盒具有良好的灵敏度。 阳160] 总么W6D6anti为包被抗体，W2H10anti或者抓6anti为标记抗体检测口蹄疫 0型（0/GX/09-7)，均能够实现高灵敏度检测，检测灵敏度约在化g/血附近。 阳1W] S、用单克隆抗体抓6anti、2化Oanti及化ISA双抗体夹屯、法检测口蹄疫0型（0/ GX/09-7)病毒的特异性检测
[0162] 用单克隆抗体抓6anti、2化Oanti及化ISA双抗体夹屯、法检测口蹄疫0型（0/ Mya98/BY/2010)病毒、口蹄疫 0 型（0/GX/09-7)、亚洲 1 型（J化/06)和A型巧e-A/WH/09) 病毒（病毒均用样品稀释液稀释成lOOOng/血，样品稀释液配方：胞2册〇4? 12&0,2. 9g; 胞&口〇4.2&0,0. 296g;化Cl，8. 5g;Proclin300,0. 6mL;BSA，IOg;胎牛血清，150mL;硫酸庆 大霉素，2支（8万单位/支）；双蒸水，定溶至1000血；调整抑至7. 6-7. 8。过滤除菌，2-8°C 保存），W确定检测方法的特异性，检测方法见步骤一、二。
[0163] 结果：W单克隆抗体抓6anti为包被抗体，W2H10anti或者抓6anti为标记抗体 检测，口蹄疫0型（0/Mya98/BY/2010)、亚洲1型（J化/06)和A型巧e-A/WH/09)病毒检测 结果呈阴性（OD值《阴性对照的2倍），无交叉反应，而口蹄疫0型（0/GX/09-7)病毒检测 结果呈阳性（〇〇值> 阴性对照的2倍），说明W单克隆抗体抓6anti为包被抗体（2化Oanti 或者抓6anti为标记抗体），采用ELISA双抗体夹屯、两步法能够特异性地识别口蹄疫0型 (0/GX/09-7)病毒，与 口蹄疫 0 型（0/Mya98/BY/2010)、亚洲 1 型（J化/06)和A型巧e-A/ WH/09)病毒等其它病毒无任何反应。
[0164] 而W单克隆抗体2H10anti包被抗体，W2H10anti为标记抗体检测，结果显示上述 口蹄疫病毒毒株均反应，表明单克隆抗体2H10anti对口蹄疫0型（0/GX/09-7)为非特异性 的。W单克隆抗体2H10anti包被抗体，W抓6anti为标记抗体检测，虽然只有O/GX/09-7 有阳性结果，其余不反应；但是在多种毒株混合检测时，非特异性的毒株会干扰检测，影响 检测结果的准确性。 阳1化]综合考虑W上结果及应用，本发明确定单克隆抗体2H10anti或抓6anti作为ELISA双抗体夹屯、法检测口蹄疫O型（0/GX/09-7)中的标记抗体与特异性单克隆抗体 6D6anti配对使用，或者胶体金双抗体夹屯、法检测口蹄疫O型（0/GX/09-7)中，单克隆抗体 2H10anti或抓6anti作为包被抗体与特异性单克隆抗体抓6anti配对使用特异性检测口蹄 疫O型（0/GX/09-7)病毒。 阳166] 四、制备用ELISA双抗体夹心法检测口蹄疫O型（0/GX/09-7)病毒的试剂盒 阳167] 本发明提供一种检测口蹄疫O型（0/GX/09-7)病毒的试剂盒，其中包括口蹄疫O型（0/GX/09-7)病毒的特异性单克隆抗体抓6anti。
[0168] 具体的，可为用ELISA双抗体夹屯、法检测口蹄疫0型（0/GX/09-7)病毒的化ISA 试剂盒，其中用口蹄疫0型（0/GX/09-7)病毒的特异性单克隆抗体抓6anti作为包被抗体 包被的微孔板，和用6D6anti作为酶标抗体的酶标记抗体工作液。
[0169] 更具体的，W单克隆抗体抓6anti既作为包被抗体又作为标记抗体，用化ISA双抗 体夹屯、两步法检测口蹄疫0型（0/GX/09-7)病毒的试剂盒包括W下试剂：
[0170] 1)预包被微孔板：预先用单克隆抗体抓6anti按照4yg/mL的浓度预先包被、封 闭，并密封保存在真空侣锥袋中，每个试剂盒一块96孔的微孔板； 阳171] 2)酶标记抗体工作液：预先用辣根过氧化物酶（HR巧或碱性憐酸醋酶（AL巧标记 的抓6anti抗体，并用酶标记抗体稀释液稀释成合适浓度作为工作液，通常为0. 1-1. 0yg/mU每个试剂盒10.OmL。 阳17引 酶标记抗体稀释液配方为：胞2册〇4 ? 12&0,2. 9g;胞&口〇4 ? 2&0,0. 296g;化Cl, 8. 5g!Proclin300,0. 6血巧SA，IOg;胎牛血清，150血；酶稳定剂（购自上海西宝生物科技 有限公司），5g;Tween-20 0. 25血；双蒸水，定溶至1000血；调整抑至7. 6-7. 8。
[0173] 3)稀释液：用于标准品和待测样品的稀释，其配方为胞2册〇4 ? 12&0, 2. 9g; 胞&口〇4.2&0,0. 296g;化Cl，8.5g;Proclin300,0. 6mL;BSA，IOg