)中，并且再用苄基溴（0. 87mL，7. 24mmol) 处理。在10分钟内，溶液开始脱色，并且变成均匀。4小时后，用甲苯稀释该溶液，并且用 水（3X)洗涤，干燥（MgS04)并且蒸发。通过快速硅胶色谱法纯化残留物，用8:1、然后用 6:1ΕΑ:ΡΕ(60/80)洗脱。蒸发包含产物的级分，得到化合物34b(1.031g，62% )，为白色固 体。
[0256] 2.用于制备化合物34d的方法
[0257]
[0258] 向现许的勝酸HH34cU. <3Ug，fc>· 和脸34bU.UMg，4. 的 THF(lOmL)溶液中加入四甲基胍（1. 25mL，9. 94mmol)。将该反应混合物在环境温度搅拌16 小时。用水稀释该反应混合物，并且蒸发THF。使用1M盐酸水溶液酸化残留物，并且用乙 酸乙酯萃取。干燥有机萃取物（MgS04)，并且蒸发，得到棕色油状物。通过快速硅胶色谱法 纯化残留物，用4:1、然后用3:1ΡΕ(60/80) :EA洗脱，得到化合物34d，为白色固体（1. 59g， 88% ) 〇
[0259] 3.用于制备化合物34e的方法
[0260]
[0261]给化合物 34d(l· 59g，3. 97mmol)和铑（S,S)-diEtDuPhos] [C0D]0Tf(57mg， 0.079mmol)的甲醇（90mL)溶液脱气。将产生的溶液在氢气球压力下搅拌2小时。对该反 应混合物的1HNMR分析显示反应未发生。
[0262] 将该反应混合物加入到高压反应容器中并且脱气。再加入催化剂（57mg， 0. 079mmol)，并且给该溶液脱气，并且在5巴氢气压力下搅拌3小时。蒸发该反应混合物， 并且通过快速色谱法纯化残留物，用在PE(60/80)中的25%EA洗脱，得到化合物34e，为无 色油状物（1.46g，91% )。
[0263] 4.用于制备化合物34f的方法
[0264]
[0265] 将化合物34e(1. 46g，3. 63mmol)在THF(15mL)中搅拌，并且一次性加入一水合氢 氧化锂（380mg，9. 07mmol)。继续搅拌1小时。再加入一水合氢氧化锂（76mg，1. 81mmol)， 并且继续搅拌30分钟。用1M盐酸水溶液酸化该混合物，并且用乙酸乙酯（2X)萃取，用 MgS04干燥，并且蒸发，得到化合物34f，为无色油状物（1. 44g，102% )。
[0266] 5.用于制备化合物34g的方法
[0267]
[0268] 将化合物34f(0. 73g，1. 88mmol)在1，4-二，巧备烷（10mL)中搅拌，并且用氯化氢 气体（约0. 04mol)处理。将产生的溶液在环境温度搅拌1小时。再使氯化氢气体（约 0.04mol)鼓泡通入该溶液。高度真空干燥残留物，得到化合物34g，为无色油状物（608mg， 100% ) 〇
[0269] 6.用于制备化合物34h的方法
[0270]
[0271] 向化合物34g(608mg，1. 88mmol)在1M盐酸水溶液（10mL)中的溶液中加入甲醛 水溶液（〇. 84mL，11. 3mmol，37%w/w)。将产生的溶液在60°C加热1小时，并且用乙酸钠 (1.23g，15mm〇l)的水（5mL)溶液处理。将该混合物保持在4°C达2小时，导致白色固体 形成。过滤固体，并且通过与乙醇一起共蒸发干燥，得到化合物34h，为白色固体（330mg， 59% ) 〇
[0272] 7.用于制备化合物34的方法
[0273]
[0274] 在0°C用吡啶（0. 59mL，7. 32mmol)和氯三甲基硅烷（0. 66g，5. 23mmol)处理化合 物3处(31311^，1.05_〇1)的001(101^)混悬液。5分钟后，一次性加入酰氯34丨（22411^， 0.97mmol)。将该反应混合物温至环境温度，用乙酸乙酯稀释，并且用1M盐酸水溶液（2X) 萃取，干燥（MgS04)，并且蒸发。通过快速硅胶色谱法纯化残留物，用在PE(+1 %乙酸）中的 50%EA洗脱，得到无色油状物。4NMR和MS分析显示6-苯酚未完全脱甲硅烷基化。
[0275] 将油状物溶于THF(lOmL)中，并且用四丁基氟化铵（0· 84mL，1. 0M，在THF中）处 理。2小时后，用乙酸乙酯稀释该反应混合物，用1M盐酸水溶液洗涤，干燥（MgS04)，并且蒸 发。通过快速硅胶色谱法纯化残留物，用2:1、然后用1: 1PE(60/80) :ΕΑ(+0. 5%乙酸）洗脱。 蒸发包含产物的级分，得到无色油状物。从EA(3X)中蒸发该油状物，并且干燥，得到化合 物34,为黄色泡沫状物（4. 14mg，80 % )。
[0276] 实施例3 :化合物40的制备
[0277]
[0278] 向化合物33h(2. 50g，4. 83mmol)的DCM(30mL)溶液中加入N，N-二甲基甲磺酰胺 (0· 60g，4. 83mmol)、DCC(1. 20g，5. 80mmol)和DMAP(0. 17g，1. 45mmol)，并且将该混合物在 RT搅拌过夜，TLC(DCM:Me0H= 20:l)显示大部分原料耗尽。用饱和NaHOVK溶液（30mL)、 盐水（30mLX2)洗涤该混合物，经Na2S04干燥，过滤并且真空浓缩。通过色谱法纯化残留 物（PE:EA= 1:0 至 3:1)，得到化合物 40(L68g，55% )，为白色固体。LC-MS(Agilent， SYN-LCMS-P-2) :Rt 3. 16 分钟；m/z计算值C34H35N306S[M+H]+614. 2,实测值 |Μ+Η]+614· 3。 HPLC(JULY-L) (214 和 254nm) :Rt 9· 22 分钟。
[0279] 实施例4 :化合物41的制备
[0280]
[0281]将化合物40(1. 50g，2. 44mmol)和 10%Pd(0H)2/C(100mg)在Me0H(30mL)中的混合 物在訂在氏气氛（latm)下搅拌过夜，TLC(PE:EA= 1:2)显示原料耗尽。通过过滤除去催 化剂，并且真空浓缩滤液。使残留物从PE/EA中重结晶，得到化合物41 (1. 21g，95% )，为白 色固体。1^>]\^(厶81161^，5￥^1^1^-?-2):艮3.00分钟 ；111/2计算值(：27!12具065[]\1+!1] +524.2， M+Na]+546.2,实测值[M+H]+524.2, [M+Na]+546.2。HPLC(JULY-L)(214 和 254nm) :Rt，8.89 分钟。
[0282] 实施例5 :化合物48的制备
[0283]
[0284] 将化合物 50 (150mg，0· 27mmol)、N, N-二甲基碼醜胺（41mg，0· 33mmol)、 DMAP(10mg，0.08mmol)和 DCC(68mg，0.33mmol)在 DCM(3mL)中的混合物在 RT 搅拌过夜， TLC(DCM:MeOH= 10:1)显示大部分原料耗尽。用DCM(30mL)稀释该混合物，用盐水洗涤， 经Na2S04干燥，过滤，并且真空浓缩。通过色谱法纯化残留物（DCM:MeOH = 1:0至50:1)， 得到化合物 48(7511^，43%)，为白色固体。1^：-]^(厶81161^，3￥^1^1^-?-2):艮2.89分 钟；m/z 计算值 C36H35N306S[M+H]+638. 2, [M+Na]+660. 2,实测值[Μ+Η]+638· 3, [M+Na]+660. 3。 HPLC(JULY-L) (214 和 254nm) :Rt 9· 59 分钟。
[0285] 实施例6 :化合物49的制备
[0286]
[0287] 将化合物 51 (70mg，0. 127mmol)、N，N-二甲基磺酰胺（19mg，0. 153mmol)、 DMAP(5mg，0.038mmol)和 DCC(32mg，0.153mmol)在 DCM(lmL)中的混合物在 RT 搅拌过夜， TLC(DCM:MeOH= 10:1)显示大部分原料耗尽。用DCM(30mL)稀释该混合物，用盐水洗涤， 经Na2S04干燥，过滤并且真空浓缩。通过制备型HPLC纯化残留物，得到化合物49 (40mg， 48%)，为白色固体。LC-MS(Agilent，SYN-LCMS-P-2) :Rt 2.95分钟；111/2计算值(：36!134卩队 〇6S[M+H] +656. 2, [M+Na]+678. 2,实测值[Μ+Η]+656· 2, [M+Na]+678. 2。HPLC(JULY-L) (214 和 254nm) :Rt 9· 597 分钟。
[0288] 实施例7 :化合物50的制备
[0289] 1.用于制备化合物50a的方法
[0290]
[0291] 将化合物 33h的钠盐（10.0g，18.8mmol)和 10%Pd/C(1.0g)在Me0H(150mL)中 的混合物在訂在氏气氛（latm)中搅拌过夜，TLC(DCM:MeOH= 10:1)显示原料耗尽。过 滤该混合物，并且真空浓缩滤液，得到化合物50a(8g，117% )，为白色固体，不经纯化用于 下一步。LC-MS(Agilent，SYN-LCMS-P-2) :Rt 2.97分钟；111/2计算值(：25!123勵5[]\1+!1] +418.2， [M+Na]+440. 2,实测值[Μ+Η]+418· 2, [M+Na]+440. 1。
[0292] 2.用于制备化合物50b的方法
[0293]
[0294] 向搅拌的化合物 50a(2. 00g，4. 55mmol)的Me0H(30mL)溶液中加入S0C12(0. 5mL)， 并且将该混合物回流加热3小时，TLC(DCM:MeOH= 10:1)显示原料耗尽。将该混合物冷却 至RT，真空浓缩，并且使残留物在EA与水之间分配。分离有机层，用饱和NaHC03水溶液、然 后用盐水洗涤，经Na2S04干燥，过滤，并且真空浓缩，得到化合物50b(1. 98g，100 % )，为白 色固体。LC-M5(Agilent，SYN-LCMS-P-2) :Rt 3. 01 分钟；m/z计算值C26H25N05[M+H]+432. 2， [M+Na]+454. 2,实测值[Μ+Η]+432· 2, [M+Na]+454. 2。
[0295] 3.用于制备化合物50c的方法
[0296]
[0297] 将化合物 5〇b(3〇Omg，0· 69mmol)、1_ (3_ 漠丙-1-炔基）苯（l63mg，0· 83mmol)和 K2C03(143mg，1.04mmol)在DMF(lOmL)中的混合物在 50°C加热过夜，TLC(PE:EA= 1:1)显 示原料耗尽。将该混合物冷却至RT，倾入冰-水（100mL)中，并且用醚（30mLX3)萃取。 用盐水洗涤合并的有机萃取物，经Na2S04干燥，过滤，并且真空浓缩。通过色谱法纯化残留 物（PE:EA= 1:0 至 4:1)，得到化合物 50c(270mg，71% )，为白色固体。LC-MS(Agilent， SYN-LCMS-P-2) :Rt 3. 26 分钟；m/z计算值C35H31N05[M+H]+546. 2,实测值[Μ+Η]+546· 2。
[0298] 4.用于制备化合物50的方法
[0299]
[0300] 将化合物 50c(270mg，0. 49mmol)和LiOH.H20(79mg，1. 88mmol)在THF/ H20(3mL/lmL)中的混合物在RT搅拌过夜，TLC(PE:EA= 1:1)显示原料耗尽。真空浓缩该 混合物，以除去THF，并且将残留物溶于水（30mL)中，并且用3MHC1水溶液酸化至pH~ 4。通过过滤收集产生的沉淀，并且将得到的固体溶于DCM，用盐水洗涤，经Na2S04干燥，过 滤，并且真空浓缩。使残留物从PE/EA中重结晶，得到化合物50(210mg，80% )，为白色固 体。LC-MS(Agilent，SYN-LCMS-P-2) :Rt 2. 81 分钟；m/z计算值C34H29N05[M+H]+532. 2,实测 值[Μ+Η]+532· 2。HPLC(JULY-L) (214 和 254nm) :Rt 9. 63 分钟。
[0301] 实施例8 :化合物51的制备
[0302] 1.用于制备化合物51a的方法
[0303]
[0304] 在-65°C在队气氛下向搅拌的4-氟苯基乙炔（5.0g，4L7mmol)的THF(30mL) 溶液中加入n-BuLi(2. 5M，在己烷中，18. 3mL，45. 8mmol)，并且将该混合物在-65 °C搅拌 1小时。加入低聚甲醛（2. 5g，83. 3mmol)，并且将该混合物缓慢地温至RT，并且搅拌过 夜，TLC(PE:EA= 4:1)显示原料耗尽。加入水，并且用EA(30mL)萃取该混合物。用水 (20mLX2)、盐水（20mL)洗涤有机萃取物，经Na2S04干燥，过滤，并且真空浓缩，得到化合物 51a(6. 5g，100% )，为棕色油状物，将其直接用于下一步。
[0305] 2.用于制备化合物51b的方法
[0306]
[0307]向化合物 51a(l. 0g，6. 67mmol)的THF(15mL)溶液中加入PPh3(l. 92g，7. 34mmol)， 然后加入CBr4(2. 21g，6. 67mmol)，并且将该混合物在RT搅拌过夜，TLC(PE:EA= 4:1)显示 原料耗尽。加入PE(30mL)，并且过滤该混合物。真空浓缩滤液，并且通过色谱法纯化残留物 (100%PE)，得到化合物51b(1. 5g，100% )，为无色油状物。
[0308] 3.用于制备化合物50c的方法
[0309]
[0310] 将化合物 50b(300mg，0· 69mmol)、化合物 51b(177mg，0· 83mmol)和K2C03 (143mg， 1.04mmol)在DMF(lOmL)中的混合物在50°C加热过夜，TLC(PE:EA= 1:1)显示原料耗尽。 将该混合物冷却至RT，倾入冰-水（80mL)，并且用醚（30mLX3)萃取。用盐水洗涤合并的 有机萃取物，经Na2S04干燥，过滤，并且真空浓缩。通过色谱法纯化残留物（PE:EA= 1:0至 4:1)，得到化合物 51c(280mg，72% )，为白色固体。LC-MS(Agilent，SYN-LCMS-P-2) :Rt 3. 41 分钟；m/z计算值C35H30FN05[M+H]+564. 2, [M+Na]+586. 2,实测值[Μ+Η]+564· 2, [M+Na]+586. 2。
[0311] 4.用于制备化合物51的方法
[0312]
[0313] 将化合物 51c(280mg，0. 49mmol)和LiOH.H20(63mg，1. 49mmol)在THF/ H20(3mL/lmL)中的混合物在RT搅拌过夜，TLC(PE:EA= 1:1)显示原料耗尽。真空浓缩该混 合物，以除去THF，并且将残留物溶于水（30mL)，用3MHC1水溶液酸化至pH~3,并且用DCM 萃取。用盐水洗涤有机萃取物，经Na2S04干燥，过滤，并且真空浓缩。通过色谱法纯化残留物 (DCM:MeOH= 1:0 至 100:1)，得到化合物 51(120mg，44% )，为白色固体。LC-MS(Agilent， SYN-LCMS-P-2) :Rt 3. 48 分钟；m/z计算值C34H2SFN05[M+H]+550. 2，[M+Na]+572. 2,实测值 [Μ+Η]+550·2, [M+Na]+572.2。HPLC(JULY-L)(214 和 254nm) :Rt 9.64 分钟。
[0314] 生物学实施例1 :六^受体结合
[0315] 培养基和溶液
[0316] 1.胰蛋白酶-EDTA(用于制备lOOmL)
[0317] 胰蛋白酶0. 25g
[0318] 2%EDTA2mL
[0319] PBS98mL
[0320] 将胰蛋白酶完全溶解于2%EDTA和PBS中；通过穿过0. 20μM膜过滤器来将溶液 灭菌；在4°C储存。
[0321] 2.DMEM培养基（用于制备1L)
[0322] 在温和搅拌下将粉末溶于950mL蒸馏水中直至溶液变澄清。
[0323] 添加1. 176gNaHC03用于制备DMEM培养基。
[0324] 使用1MNaOH或1MHC1调节培养基的pH至低于最终工作pHO. 2-0. 3。在搅拌下 缓慢添加。
[0325] 用ddH20稀释至1升。
[0326] 即刻通过过滤将培养基灭菌。
[0327] 在 4°C储存。
[0328] TE缓冲液
[0329] 20mMTris-HCl，ρΗ7· 4，
[0330] 5mMEDTA
[0331] 4.结合测定缓冲液
[0332] 50mM Hepes, pH7. 4
[0333] 5mMMgCl2
[0334] ImM CaCl2
[0335] 0. 2% BSA
[0336] 5.洗涤缓冲液
[0337] 50mM Hepes, pH7. 4
[0338] 用于HEK293/AT2受体瞬时细胞的方法
[0339] 转染
[0340] ?将细胞以50%密度铺板至150mm培养皿中用于瞬时转染。在过夜温育后（汇合 达到约80% )，细胞准备好进行转染。
[0341] ?温和混合于6. 25mLOptiMEMI减少血清培养基（ReducedSerumMedium)中稀 释的75yLLipofectamine? 2000,并且在室温温育5分钟。温和混合于无血清的6. 25mL OptiMEMI减少血清培养基中稀释的50μg表达质粒DNA。
[0342] ?在温育5分钟后，将稀释的DNA与稀释的Lipofectamine? 2000合并（总体积 是12. 5mL)。温和混合混合物并且在室温温育30分钟以使形成DNA-Lipofectamine? 2000 复合物。
[0343] ?添加12. 5mLDNA-Lipofectamine? 2000复合物至150mm培养皿中并且通过来 回摇动培养皿加以温和混合。
[0344] ?在37°C、5% 0)2温育细胞48小时。
[0345] ?收集细胞并且在-80 °C冷冻储存。
[0346] 用于册1(293/^1'2受体细胞膜制备的方法
[0347] ?在冰冷的TE缓冲液中将冷冻的HEK293/AT2受体（瞬时转染）细胞匀化10秒。
[0348] ?在25, 000g下离心匀化物30分钟。
[0349] ?将沉淀再混悬于冰冷的组织缓冲液中。