RYF:57-ATACAAATTTCCTGAATAGTTGCTC-3 7
[0040] SRYR：57-ACAATTCACTAGTTTAAAATGAGCA-3 7 [0041 ] SRYP:57-HEX-ACTTAGTGTAGAATGAAGAC-Dabcyl-3
[0042] 实施例2:检测方法。
[0043] 仪器：Bio-Rad S1000PCR仪，Vortex-GENIE2T漩涡振荡器，BECKMAN C0UTER Microfuge 18Centifuge离心机，Applied biosystems QuantStudio 3D数字PCR系统。
[0044] 选取2015年10月到2015年12月孕中期产妇10例，分别取外周血6ml，采用Qiagen外 周血游离DNA提取试剂盒提取游离DNA，然后按下列步骤操作：
[0045] (1)血浆游离DNA靶向捕获：将10 XHB 5yL，HP21-l (10μΜ)0 · 5yL，HP21-2( 10μΜ)0 · 5 yL，HP21-3( 10μΜ)0·5yL，HP21-4( 10μΜ)0·5yL，ccfDNA 43yL混合，95°C5min，室温静置5min 后备用；
[0046] (2)亲和素标记的磁珠 （sepharoe beads)洗涤，取30yL sepharoe beads溶液，加 200yL ddH20,振荡混勾，14000rpm离心3min，去上清留沉淀，再加 200yL ddH20,振荡混勾， 14000rpm离心3min，去上清留沉淀备用；
[0047] (3)通过选择性去除靶向捕获游离DNA富集目标DNA:将从步骤（1)获取的混合液加 入经步骤(2)处理后的sepharoe beads沉淀中，悬浮沉淀，Vertex振荡混勾10min，14000rpm 离心3min，取上清弃沉淀，上清即为靶向富集后的目标游离DNA。
[0048] (4)数字PCR，使用Applied biosystems QuantStudio 3D数字PCR系统扩增21 号染 色体目标基因以及SRY目标基因片段，比较富集前以及富集后胎儿DNA在孕妇血浆中的相对 比例。
[0049] 其中，以富集前DNA为模板的PCR扩增体系为：2 X quantstudio 3D master mix 7.5yL,DP21-l：0.135yL(100yM),DP21-2：0.135yL(100yM),DP21-3：0.6yL(10yM),SRYF： 0 · 135yL( 100μΜ)，SRYR: 0 · 135yL( 100μΜ)，SRYP: 0 · 45yL( 10μΜ)，Template 5 · 08yL，加无菌水 至15yL;以富集后DNA为模板的PCR扩增体系为：2Xquantstudio 3D master mix 7.5yL， DP21-l：0.135yL(100yM),DP21-2：0.135yL(100yM),DP21-3：0.6yL(10yM),SRYF：0.135yL (100μΜ)，SRYR:0 · 135yL(100μΜ)，SRYP:0 ·45yL( ΙΟμΜ)，Template 5 ·Qlyl^PCR扩增条件为： 94°C3min;94°C25s，55°C30s，72°C20s，40个循环；72°C3min。扩增完成后采用Applied biosystems QuantStudio 3D数字PCR系统读取并分析相关数据(表1)。
[0050] 表1 10例孕妇外周血游离DNA富集前与富集后21染色体目标基因与SRY基因数量
[0051]
[0052] 10例样本中，1、3、6、8含SRY基因片段，其余6例无 SRY基因片段，1、3、6、8采用本发 明试剂及方法进行靶向富集后其SRY基因相对比例分别从10.7 %、10.2 %、3.7 %、7.0 %提 高到了 18%、21·6%、9·9%、15·3%。
【主权项】
1. 一种外周血游离DNA靶向富集的方法，其特征在于，包括如下步骤： (1) 根据目标DNA设计杂交引物，所述的杂交引物用于靶向捕获大片段DNA，所述的杂交 引物包括上游杂交引物对和下游杂交引物对，所述的上游杂交引物对和下游杂交引物对分 别分布在靶基因扩增片段外侧两端，所述上游杂交引物对和下游杂交引物对的5'端均标记 生物素； (2) 提取外周血游离DNA; (3) 将步骤（1)设计的杂交引物与步骤(2)提取的外周血游离DNA混合，加入杂交试剂， 使杂交引物与目标DNA结合，得到混合物； (4) 将亲和素标记的磁珠与步骤(3)得到的混合物混合均匀，离心，弃沉淀，上清即为靶 向富集后的外周血游离DNA。2. 根据权利要求1所述的外周血游离DNA靶向富集的方法，其特征在于，步骤(3)中，使 富集引物与目标DNA结合的方法为:先在90°C~95°C条件下加热5~lOmin，再在15~30°C条 件下静置5~lOmin。3. 根据权利要求1所述的外周血游离DNA靶向富集的方法，其特征在于，步骤(3)中，所 述的杂交试剂为:Tris_Acetat、MgAc2。4. 根据权利要求1所述的外周血游离DNA靶向富集的方法，其特征在于，步骤(3)中，杂 交引物与目标DNA结合的体系中，杂交引物含量分别为0.05~0.2ymol/L。5.根据权利要求1所述的外周血游离DNA靶向富集的方法，其特征在于，步骤(3)中，杂 交引物与目标DNA结合的体系中，Tris-Acetat含量为20~40mM，MgAc2含量为2~4mM。6. 根据权利要求1所述的外周血游离DNA靶向富集的方法，其特征在于，步骤（1)中，所 述的上游引物对和下游引物对的分别长度为15~39bp，所述的上游引物对和下游引物对在 50mMNa+条件下Tm均不小于50°C。7. 根据权利要求1所述的外周血游离DNA靶向富集的方法，其特征在于，步骤（1)中，所 述的上游引物对间相距不超过20bp，所述的下游引物对间相距不超过20bp。8. 外周血游离DNA靶向富集与检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括： 杂交试剂：200mMTris-Acetat、20mMMgAc2; 亲和素标记的磁珠； 杂交引物:所述的杂交引物用于靶向捕获大片段DNA，所述的杂交引物包括上游杂交引 物对和下游杂交引物对，所述的上游杂交引物对和下游杂交引物对分别分布在靶基因扩增 片段外侧两端，所述上游杂交引物对和下游杂交引物对的5'端均标记生物素，所述的上游 引物对和下游引物对的分别长度为15~39bp，所述的上游引物对和下游引物对在50mMNa+ 条件下Tm均不小于50°C，所述的上游引物对间相距不超过20bp，所述的下游引物对间相距 不超过20bp。9. 根据权利要求8所述的外周血游离DNA靶向富集的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包 括检测靶基因的引物和检测靶基因的探针。
【专利摘要】本发明提供了一种外周血游离DNA靶向富集的方法，属于分子检测技术领域。该方法主要根据外周血游离DNA中不同来源的DNA片段大小的差异选择性去除大片段DNA从而达到靶向富集小片段DNA的目的。通过本发明所得到的靶向富集后的外周血游离DNA可广泛应用于下游诸多分子诊断，如基于检测母体血浆中胎儿游离DNA的无创性产前分子诊断(NITP)等。
【IPC分类】C12N15/10, C12Q1/68
【公开号】CN105441426
【申请号】CN201511027421
【发明人】任绪义, 张峰, 俞岳峰, 吕江峰
【申请人】杭州迪安医学检验中心有限公司
【公开日】2016年3月30日
【申请日】2015年12月31日