1b(+)、pET28a(+)和pET30a(+) (Novagen)连接，获得pET21b-AD0-AAR(即pAL87,图 3)、pET28b-AAR、pET30a-AD0质粒，将连接产物转化BL21 (DE3)ΛfadE，筛选阳性克隆进行 测序，分别挑取序列正确的菌株提取质粒。
[0091] (2)利用步骤（1)构建的质粒pET21b-AD0-AAR、pET28b-AAR与实施例（1)中构建 的质粒PWW02分别进行如下操作：
[0092]将pffff02 单独转化BL21 (DE3)ΛfadE，获得WW03;
[0093]将pffff02 与pET21b-AD0-AAR(即pAL87)质粒共同转化BL21 (DE3)ΛfadE，获得 WW04 ；
[0094]将pffff02 与pET28b-AAR质粒共同转化BL21 (DE3)ΛfadE，获得WW05;
[0095] 将所构建的WW03、WW04和WW05分别在LB培养基中30°C，250rpm下过夜培养， 而后按l:50(v/v)将过夜培养液转接至新鲜改良M9培养基中，培养至对数期（0D600 = 0. 6-0. 8)，再加入0. 5mmol/LIPTG作为AAR与ADO的诱导剂，细胞在30°C继续培养约16h后，取5μ1菌液在荧光显微镜下观察细胞荧光。
[0096] 结果如图4所示，与对照组（WW03、WW05)相比，构建体WW04在诱导后可以观察到 显著的绿色荧光；当细胞中没有完整产烃途径时（如Wff〇3、ffff05)，细胞仅表现出微弱荧光， 和GFP的渗漏表达有关，但这种渗漏表达产生的荧光远低于诱导后的荧光信号强度；此外， 单独表达AAR的细胞（醫05)荧光信号与醫03相比无明显差别，表明E.coli中单独表达 AAR不能够合成脂肪经，因而不能够诱导GFP的表达。上述结果证明所述构建体能够用于大 肠杆菌细胞内合成脂肪烃的原位检测。
[0097]实施例3:构建体的荧光强度与细胞内脂肪烃浓度呈正相关性
[0098] 菌株：
[0099]大肠杆菌BL21 (DE3)ΛfadE
[0100] 载体：
[0101] pffff02 ；pAL87
[0102] 培养基：
[0103]LB培养基（含胰蛋白胨10g/L，酵母浸膏粉5g/L，NaC110g/L，若为固体培养基，则 每升培养基添加琼脂15g)
[0104]改良M9 培养基（含 6g/LNa2HP04, 3g/LKH2P04, 0· 5g/LNaCl, 2g/LNH4C1, 0· 25g/ LMgS04 · 7H20,llmg/LCaCl2, 27mg/LFeCl3 · 6H20, 2mg/LZnCl2 · 4H20, 2mg/ LNa2Mo04 · 2H20, 1. 9mg/LCuS04 · 5H20, 0· 5mg/LH3B03,lmg/L维生素Bl, 200mM Bis-Tris(pH7. 25)和 0· 1% (v/v)Triton-X100)
[0105] 实施步骤：将上述携带pffff02和pAL87的大肠杆菌BL21 (DE3)ΛfadE(WW04)在LB 培养基中37°C，250rpm下过夜培养，而后按1:50 (v/v)将过夜培养液转接至新鲜改良M9培 养基中，培养至对数期（0D600 = 0. 6-0. 8)，分别取培养至对数生长期的培养液并向其中分 别加入诱导剂IPTG至以下终浓度（mmol/L) :0. 01，0. 02,0. 03,0. 05,0. 5。上述各培养液细 胞在30°C继续分别培养约12h后，分别取5μL菌液在荧光显微镜下观察细胞荧光；而后再 分别取25μL菌液，用175μLddH20稀释，分别在荧光酶标仪中定量检测稀释后菌液的吸 光度（600nm)和相对荧光强度（激发波长为485nm，发射波长为516nm)，用相对荧光强度除 以相应吸光度，即得到等细胞浓度菌液的相对荧光强度。
[0106] 将上述稀释的各菌液继续培养约24h，培养后分别取10mL菌液超声破碎，粉碎后 分别加入10mL氯仿和甲醇（氯仿与甲醇按体积比2:1混合）溶液充分震荡，分别在4°C 离心（8000g，10min)取各自下层有机相吹干后用色谱纯正己烷溶解，用GC-MS检测样品中 的脂肪烃含量，检测条件如下：采用配备有HP-INN0Wax(30mX250μmXO. 25μm)色谱柱的 Agilent7890A气相色谱，使用Helium为载气，流速为lmL/min。进样量为1μL，进样口温度 为250°C。GC-MS测试程序为：40°Clmin，以5°C/min的速率升至200°C，然后以25°C/min 的速率升至240°C，在240°C维持15min。利用正二十烷作为内标计算脂肪烃浓度。）。
[0107] 如图5所示，随着IPTG浓度逐渐升高，脂肪烃（包括正十五烷和十七烯）含量逐 渐提高，与细胞荧光强度呈较为一致的正相关性。由于IPTG对于报告蛋白并无直接的诱导 作用，以上结果表明构建体中报告蛋白的表达水平能够定性或半定量反映细胞内脂肪烃的 含量。因此，可以利用所述构建体检测细胞内脂肪烃的浓度。
[0108] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1. 一种检测微生物细胞中脂肪烃的构建体，其特征在于：构建体包含至少一个脂肪烃 检测元件和一个报告蛋白元件； 脂肪烃检测元件由具有脂肪烃响应特性的转录激活因子和启动子组成；所述报告蛋白 兀件为能够在宿王中功能性表达和被检测的蛋白质。2. 根据权利要求1所述的检测微生物细胞中脂肪烃的构建体，其特征在于：所述构建 体包含由启动子PalkS、转录激活因子AlkR和启动子PalkM组成的脂肪烃检测元件；以及 以绿色荧光蛋白、LacZ、荧光素酶或抗性基因作为的报告蛋白元件。3. -种原位快速检测细胞内脂肪烃的方法，其特征在于：利用所述构建体将其导入宿 主细胞，再将宿主细胞进行培养并诱导其合成脂肪烃，而后通过检测报告蛋白的表达，从而 实现对细胞内脂肪烃的检测。4. 按权利要求3所述的原位快速检测细胞内脂肪烃的方法，其特征在于：所述检测是 将编码脂肪烃检测元件与报告蛋白基因的DNA通过聚合酶链式反应连接入含有抗性基因 的表达载体中，将所述表达载体导入含有产烃途径或潜在产烃途径的宿主细胞中；将所述 宿主在添加相应抗生素的培养基中进行培养并诱导其合成脂肪烃，继续培养而后检测报告 蛋白的表达水平，即检测到报告蛋白的信号，由此获得脂肪烃的含量。5. 按权利要求3或4所述的原位快速检测细胞内脂肪烃的方法，其特征在于：所述脂 肪烃为中长链脂肪烃。6. 按权利要求3或4所述的原位快速检测细胞内脂肪烃的方法，其特征在于：所述宿 主细胞为大肠杆菌、酵母或蓝细菌。
【专利摘要】本发明涉及基因工程与生物能源领域，具体而言是一种检测微生物细胞中脂肪烃的构建体及利用构建体原位检测脂肪烃的方法。构建体包含至少一个脂肪烃检测元件和一个报告蛋白元件；脂肪烃检测元件由具有脂肪烃响应特性的转录激活因子和启动子组成；所述报告蛋白元件为能够在宿主中功能性表达和被检测的蛋白质。测定方法，利用所述构建体将其导入宿主细胞，再将宿主细胞进行培养并诱导其合成脂肪烃，而后通过检测报告蛋白的表达，从而实现对细胞内脂肪烃的检测。本发明方法操作步骤简单，设备要求低，可同时检测大量样品，也可用于对已知脂肪烃生物合成相关的酶和蛋白质或潜在产烃途径的进化和高通量筛选中。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/70, C12Q1/02
【公开号】CN105463005
【申请号】CN201410450056
【发明人】吕雪峰, 吴伟, 姚伦
【申请人】中国科学院青岛生物能源与过程研究所, 波音(中国)投资有限公司
【公开日】2016年4月6日
【申请日】2014年9月4日