序列，以及荧光蛋白基因（GFP)序列设计相关引物，所 述引物序列见表1。
[0069]表1用于组装质粒和外源基因克隆的引物
[0070]
[0072] 据上述表格，将引物序列依次编号为如SEQIDNo.2~SEQIDNo.25所示多核苷 酸序列。
[0073] 以_20°C保存的QM9414菌株基因组DNA或含gfp基因的质粒为模板，进行PCR扩增获 得两端为重叠序列的模块片段。
[0074] 其中，PCR反应体系为：
[0076]PCR反应条件为：
[0078] (2)表达载体的模块化组装与验证
[0079] 在重组酶的作用下，将PCR扩增得到的模块片段组装成Ppki-gfp_Tcbh2、Ppki-hph-Tcbh2 或Ptefl-gfp-Tegll的结构克隆到pSIMPLE-19EcoRVBAP载体上，获得质粒pS頂PLE-19-Ppki-gfp-Tcbh2 如图 1 所示，质粒pS頂PLE-19-Ppki-hph-Tcbh2 如图 2 所示，质 粒pS頂PLE-19-Ptefl-gfp-Tegll如图 3 所示。
[0080]其中，克隆反应体系为：
[0083]利用限制性内切酶HindIII、XbaI和Spel验证正确构建的质粒，酶切反应体系如 下：
[0085](3)快速检测外源基因表达的质粒构建
[0086]本实施例中的外源基因以脂酰辅酶A还原酶(FAR)为例，通过PCR及酶切连接的方 法将来源于拟南芥(Arabidopsis thaliana)或仓鸦(Tyto alba)的FAR编码基因（缺失终止 密码子)克隆到pS頂PLE-19-Ppki-gfp-Tcbh2质粒中gfp的上游。
[0087]利用限制性内切酶验证正确构建的质粒并测序确证如图4所示。
[0088]实施例2:里氏木霉的转化
[0089] 将上述构建的含有GFP或者FAR-GFP结构的质粒与pS頂PLE-19-Ppki-hph-Tcbh2质 粒共转化QM9414，通过原生质体转化的方式进行，具体操作步骤如下：
[0090] 1新鲜菌丝的培养
[0091]取新鲜的(两周以内）充分产孢的里氏木霉QM9414培养平板，使用孢子洗脱液将菌 丝及孢子刮下，剪头枪头将孢子悬液吹散均匀，双层擦净纸过滤得到用于接种的孢子悬液； [0092]将合适大小的灭菌玻璃纸铺在MEX平板上，用涂布棒铺平，取50-100yL孢子悬液滴 在玻璃纸上，并涂布均匀，准备8-10个平板，28°C培养16-20h;
[0093] 2原生质体的制备
[0094] 制备细胞酶解液:将O.lg裂解酶充分溶解在20mLSolutionA，并使用0.2μπι无菌 滤膜过滤除菌至无菌50mL离心管中，即得细胞裂解液；
[0095]在无菌培养皿中加入2_3mL细胞裂解液，将长有萌发孢子的玻璃纸在培养皿中放 置平整，在其上加入2-3mL裂解液，然后依次将所有的玻璃纸放置在同一个培养皿中，注意 避免在不同的玻璃纸间产生气泡，28°C酶解90min;
[0096]将玻璃纸小心除去，将酶解液通过四层擦净纸过滤至冰上放置的50mL离心管，并 用少量SolutionA洗涤，2000rpm4°C离心10min，去除上清并用4mLSolutionB重悬沉淀， 再次2000rpm4°C离心10min，0.5-lmLSolutionB重悬沉淀，即得原生质体。
[0097] 3原生质体转化
[0098]在冰上放置的15mL离心管中加入如下组分：
[0099] 200yL原生质体悬液，10yL质粒（5yL表达质粒+5yLpS頂PLE-19-Ppki-hph-Tcbh2 质粒），50yLPEG缓冲液
[0100] 混合均匀，冰上放置20min;
[0101] 加入2mLPEG缓冲液，混合均匀，室温放置5min;
[0102] 加入4mLSolutionB，混合均勾
[0103] 4原生质体转化子再生
[0104]将0.2-lmL转化液与4mL上层培养基混合均匀，倾倒在底层培养基上，待培养基凝 固后移至28°C培养，一般2-4天可见转化子长出，根据不同需求进行后续的转化子验证。
[0105]所需缓冲液及培养基：
[0106]孢子洗脱液：0·8-0·9 % NaCl，0·05%Tween
[0107]SolutionΑ:0·1ΜΚΗ2Ρ〇4，1·2Μ山梨醇，pH5.6
[0108]SolutionB:50mMCaCl2，lM山梨醇，lOmMTris·HCl，pH7.5
[0109]PEG缓冲液：25%PEG6000,50mMCaCl2，10mMTris·HCl，pH7.5
[0110] 下层培养基:基础培养基，2 %琼脂，1M山梨醇，100mg/L潮霉素
[0111] 上层培养基:基础培养基，2 %琼脂糖，1M山梨醇，100mg/L潮霉素
[0112] 实施例3:转化子的产孢与分析
[0113] (1)转化子的培养产孢与收集
[0114]将转化子菌块挑至新的筛选培养基(无山梨醇）上进行培养，每个平板可挑8个转 化子，28°C培养至产孢。
[0115]用7ml无菌水冲洗平板上的孢子(所有转化子的孢子），重悬混匀，4层擦镜纸过滤 至无菌15ml尖底离心管中，即为流式细胞仪分析及分选的孢子悬液，孢子浓度控制在105至 10 7个孢子/mL。
[0116]流式细胞仪分析转化子孢子
[0117] 转化子孢子的分析使用MoFloXDP(Beckman)流式细胞仪进行，样品压力设为 20000EPS(每秒分析20000个信号颗粒）；利用前向角散射光面积和宽度图，去除粘连和杂信 号；荧光信号使用488nm激光激发，FL1通道(529/28滤光片）分析;利用GFP表达的阴阳性对 照菌株设定电压以分辨表达GFP的孢子集群。根据阴阳性孢子的信号差别，设门（R)圈定阳 性孢子区域，所有样品的分析在相同的方法下进行。
[0118]具体为：
[0119] a)应用流式细胞仪分析转化子孢子I和丝状真菌孢子获得分析图1(如图5和图6所 示)和分析图Π(如图7所示），分析图I中沿横坐标排布有孢子群I和孢子群Π，根据分布在 分析图I右侧的孢子群Π的分布范围设定圈定门，（图中矩形方框），在分析图Π中应用所述 圈定门圈定孢子群m;
[0120] b)构建带有丝状真菌启动子、荧光蛋白表达基因、待测外源基因和终止子的丝状 真菌的转化子π;以及
[0121 ] C)重复a)和b)，应用流式细胞仪分析转化子孢子Π获得分析图m(如图8和图9所 示），应用所述圈定门在分析图m中圈定范围，当落入所述圈定门内的孢子群IV中孢子数量 超过孢子群m中孢子数量时，判定所述待测外源基因成功表达，如图8中的圈定门内的阳性 包子群数量高于图7中圈定门内孢子数量，因此，表示该外源基因far成功表达；当落入圈定 门内的孢子群IV中孢子数量低于孢子群m中孢子数量时，判定所述待测外源基因没有成功 表达;如图9中的圈定门内的阳性包子群数量低于图7中圈定门内孢子数量，因此，表示该外 源基因farl没有成功表达。
[0122] 实施例4:脂酰辅酶A还原酶整合转化子分选
[0123]用上述的操作步骤和方法分析整合FAR-GFP的孢子，并分析孢子集群在圈定门（表 达GFP的孢子的阳性区域）内的分布律，并与GFP信号的阴性孢子集群比较，通过分布律之间 的显著差异，确定