X-glu底物的显色反应检测H10::PARA-GusA菌株中GusA基因的诱导表达，深色的反应混合物代表了 GusA的表达。离心管的编号，1，不含粗酶液的负对照；2，H10::pARA-PpFbFPm ;3，未添加阿拉伯糖的H10::pARA-GusA ;4_6，阿拉伯糖的添加量分别为0.1，1和10。B.以MUG为底物测定GusA的酶活(0_6h)，以lg/L的阿拉伯糖诱导剂。C.诱导剂量对GusA酶活的影响。底物为MUG，诱导时间2h。
图4为解纤维梭菌H10菌株碳源利用及生长发酵分析。碳源为0.5%的L-阿拉伯糖或混合碳源(L-阿拉伯糖+纤维二糖，L-阿拉伯糖+D-木糖或L-阿拉伯糖+D-葡萄糖)。通过测定600nm处的吸光值监测细胞的生长状况(方块)。HPLC检测培养基中残余碳源。三角，L-阿拉伯糖；菱形，纤维二糖；圆圈，木糖；十字，葡萄糖。平均值和标准差通过三次重复实验获得。
[0021]图5为诱导剂特异性分析及诱导系统抑制性分析。以终浓度为0.l%(w/v)的不同种类的糖，包括L-阿拉伯糖、D-阿拉伯糖、D-葡萄糖、D-木糖、D-果糖、D-半乳糖及D-甘露糖，为诱导剂测定本发明诱导系统的诱导特异性。以0.1%的L-阿拉伯糖与0.1%或1%的其它糖类的混合物作为诱导剂分析诱导系统抑制性。以未添加诱导剂的空白组作为对照，所有样品的数值均为扣除空白对照的标准化值。诱导时间为2小时，平均值和标准差通过三次重复实验获得。
[0022]图6为反向筛选标记MazF效果分析。H10::pARA_MazE/F⑷和H10::pARA-PpFbFPm (B)涂布于含有红霉素或阿拉伯糖的GS-2固体培养基上(以+或-上标代表红霉素或阿拉伯糖的添加与否)。
[0023]图7为诱导型ClosTron系统工作流程图。基因敲除和质粒消除方法按照文献报道的两步法进行(Appl Microb1l B1techno 1 2014; 98:313-23)。每一步中分别包含4个或3个具体操作方法。绿色虚线表示出本发明设计的阿拉伯糖诱导表达系统。
[0024]图8为解纤维梭菌H10转化子PCR检测结果。携带质粒pARA-PyrF-mspI或pARA-PyrF-cipC的H10转化子的PCR验证(详见图6中的构建步骤1_4)。转化子首先在无抗生素培养基中生长到对数中期，而后添加1 g/L的阿拉伯糖，诱导后分别培养0、1、2和4小时。箭头代表含有完整内含子的突变体。300-400bp的条带代表野生菌株。M，DNA marker(从上到下分别是，5000、3000、2000、1500、1000、800、500 和 300bp)
图9为解纤维梭菌菌株HlOApyrFAmspI (A)和H10 Λ pyrF Λ cipC (B)突变体的PCR验证。携带质粒pARA-PyrF-mspI或pARA-PyrF-cipC的H10 Δ pyrF转化子培养在不含抗生素的GS-2液体培养基中(详见图7 step 1_3)，加入阿拉伯糖诱导4小时后，涂布在F0A平板上以消除质粒(详见图7 step 2_1).每个重组菌株挑取48个单克隆进行菌落PCR(详见图7 step 2-2).完整内含子产物如箭头所示(约1.3Kb)，野生菌株的条带大小约为0.4或0.3Kb。HlOApyrF::pARA-PyrF-mspI菌株48个克隆中3个为目标突变体H10 ΔpyrF AmspI, H10 ΔpyrF::pARA-PyrF-cipC菌株48个克隆中6个为目标突变体HlOApyrFAcipCo M，DNA maker (从上到下分别为 5000、3000、2000、1500、1000、800、500 和 300bp)
图10为解纤维梭菌H10突变株DNA印迹检测结果。(A) mspl突变株；(B)cipC敲除突变体。H10 Δ pyrF为负对照NC。2-4，6，7，利用诱导型ClosTron方法获得的H10 Δ pyrF Δ mspl突变株；9_11，13，14，利用诱导型ClosTron方法获得的H10 Λ pyrF Λ cipC突变株。1，5，利用已报道的ClosTron方法构建的H10::MspI297s ；8, 12,利用已报道的ClosTron方法构建的H10ApyrF::CipC117a菌株。6，7，13，14，预先在含红霉素的GS-2液体培养基中培养再进行阿拉伯糖诱导；2_4，9-11，阿拉伯糖诱导前未在含红霉素的GS-2液体培养基中培养。L-阿拉伯糖的诱导时间分别为0小时(2，6，9，13)，2小时(3，10)或4小时(4，7，11，14)。
【具体实施方式】
[0025]下面结合附图对本发明作进一步说明。
[0026]实施例1.构建阿拉伯糖诱导系统
我们选择丙酮丁醇梭菌磷酸转酮酶启动子和AraR抑制子表达框来构建阿拉伯糖诱导系统。选择磷酸转酮酶基因上游370 bp作为启动子以保证囊括AraR结合区。araR表达框使用了经过预测的自身启动子和终止子，并可实现自我调控。
[0027]该阿拉伯糖诱导系统的构建包括:
1)通过PCR扩增获得反馈抑制蛋白AraR的结构基因(SEQ ID NO: 1)及其启动子区ParaR (SEQ ID NO: 3)和终止子区 TaraR (SEQ ID NO: 4)；
2)通过PCR扩增获得具有反馈抑制蛋白结合位点的启动子元件Para(SEQID NO: 2)；
3)通过基因克隆的方法将上述元件整合到一个具有抗性基因的质粒骨架上，并在具有反馈抑制蛋白结合位点的启动子区下游设计酶切位点，用于目标基因的克隆，从而获得具有诱导表达系统的质粒pARA (图1，SEQ ID NO: 5)。
[0028]4)通过基因克隆将目标基因连接到pARA上PaM(SEQ ID NO: 2)下游设计的酶切位点上，获得特异性诱导表达目标基因的重组质粒。
[0029]实施例2.解纤维梭菌的电转化
根据文献(J Microb1l Methods 2012; 89:201-8)报道，转化方法为:解纤维梭菌菌体在100mL GS-2液体培养基中34°C条件下生长到0D600=0.4-0.8，3000g, 10分钟离心收集菌体，使用电转缓冲液(0.275 mol/L蔗糖，5臟01/11(2即04)洗2次后定容到lmL，取200 μ L菌液与1 μ g质粒混合放入0.2cm电转杯进行电击。电转仪参数设置为:电压1200，频率2000，占空比10%，电击次数40。电转化后的菌液加入到5mL新鲜的GS-2培养基中，34°C复苏培养6小时。复苏后的菌体经离心涂布于含有红霉素抗生素的GS-2固体平板上，在34°C厌氧条件下培养，直至长出菌落(约4-6天)。该菌落即为阳性转化子实施例3.厌氧荧光蛋白PpFbFPm在解纤维梭菌中的诱导表达
我们选择PpFbFPm作为报告基因(J Microb1l Methods 2012;89:201-8)来证明阿拉伯糖诱导系统在解纤维梭菌H10菌株中可用。
[0030]PpFbFPm通过Nhel和Sail两个酶切位点连接到pARA质粒的PaM下游，获得质粒pARA-PpFbFPm。通过基因克隆的方法，将质粒pARA-PpFbFPm上的AraR的结构基因及其启动子区？31^和终止子区TaMR去掉，即获得质粒pPTK-PpFbFPm。包含有Para-PpFbFPm和AraR表达框的pARA-PpFbFPm质粒被用来证明阿拉伯糖诱导系统调控的PpFbFPm在解纤维梭菌中的表达。对照组质粒pPTK-PpFbFPm没有AraR表达框，用来组成型表达PpFbFPm (图2A)。质粒pARA-PpFbFPm和pPTK-PpFbFPm的转化同实施例2，阳性转化子记为H10:: pARA-PpFbFPm或 H10::pPTK-PpFbFPm。
[0031]携带有pPTK-PpFbFPm 或 pARA-PpFbFPm 质粒的转化子 H10::pARA_PpFbFPm 或H10::pPTK-PpFbFPm在添加或不添加L-阿拉伯糖的GS-2液体培养基中培养，PpFbFPm的胞内表达通过绿色荧光成像来检测。使用BX51TRF荧光显微镜(奥林巴斯公司，日本)成像，成像条件为 Ex = 460-490 nm, Em = 520 nm。
[0032]不管是否有L-阿拉伯糖，转化子H10::pPTK-PpFbFPm都能观察到强烈的荧光(图2A)。与之相反，H10::pARA-PpFbFPm在没有L-阿拉伯糖诱导时不会产生绿色荧光(图2B)，说明araR是抑制子而不是激活子。在添加有L-阿拉伯糖时，H10::pARA-PpFbFPm细胞产生的绿色荧光强度与H10::pPTK-PpFbFPm相似，说明L-阿拉伯糖可以强烈的诱导PpFbFPm的表达。以上结果显示该诱导系统能够很好的控制目标蛋白在解纤维梭菌中的表达。
[0033]实施例4葡萄糖醛酸酶GusA诱导表达
我们选择GusA作为报告基因(Metab Eng 2012; 14:59-67)来验证阿拉伯糖诱导系统在解纤维梭菌H10菌株中的诱导效率及严谨性。GusA通过Nhel和Sail两个酶切位点连接到pARA质粒的PaM下游，获得质粒pARA-GusA。质粒pARA_GusA通过电转化的方法转化进入解纤维梭菌，获得转化子H10::pARA-GusA,电转化条件同实施例2。
[0034]转化子H10::pARA-GusA的粗酶液通过GusA活