echno 12014; 98:313-23 )，目标菌株 H10 Λ pyrF AmspI 和 H10 Λ pyrF Δ cipC 通过两步筛选获得(图7)。首先转化子需要在没有抗生素的培养基中生长，并用L-阿拉伯糖进行诱导，控制内含子RNA的表达。诱导效果用菌落PCR进行验证，结果显示，两种转化子都含有野生株条带和突变株条带(图.8)，说明菌落是野生株和突变株的混合物。但是，突变株条带会随着诱导时间的延长而加深，这说明阿拉伯糖诱导系统能够调控二类内含子元件的表达。
[0052]实施例9.诱导型ClosTron系统打靶效率分析
转化子 H10::pARA-PyrF-?6./?/ 和 H10::pARA-PyrF_ci/^ 经过 L-阿拉伯糖 0、2、4 小时的诱导后在含有5-氟乳清酸(F0A)的GS-2平板上筛选，每种转化子随机挑选48或96个菌落进行PCR验证，只含有单一 PCR条带的克隆即是本轮筛选的目标突变菌株(图9)。目标突变菌株的数量与挑选菌株的总数量的比值为敲除效率。质粒pARA-PyrF-as^/的敲除效率为4.2-6.3%,并且基本不受L-阿拉伯糖及诱导时间的影响。但是，诱导时间从0小时延长到4小时后，质粒H10::pARA-PyrF-ci/^的敲除效率提高了 4倍，从3.1%升高到了 12.5%。
[0053]实施例10.诱导型ClosTron系统打靶效率优化
为了提高内含子的插入效率，转化子H10:: pARA-PyrF-ffiSj?/和H10:: pARA-PyrF-ci>C在筛选前先在含有红霉素的液体GS-2培养基中传代，通过L-阿拉伯糖0、2、4小时的诱导后在含有5-氟乳清酸(F0A)的GS-2平板上筛选，每种转化子随机挑选48或96个菌落进行PCR验证，只含有单一 PCR条带的克隆即是本轮筛选的目标突变菌株(图9)。目标突变菌株的数量与挑选菌株的总数量的比值为敲除效率。质粒pARA-PyrF-as^/的敲除效率基本没有受到传代的影响，而质粒pARA-PyrF-ci/^的敲除效率却有了一定的提高。在没有L-阿拉伯糖诱导时，其敲除效率提高到了 10.4% ;在经过L-阿拉伯糖诱导4小时后，敲除效率提高到了 16.7%。
[0054]实施例11.诱导型ClosTron系统打祀特异性分析
为了确认诱导型ClosTron系统的打靶特异性，所有经过实施例9和10的PCR验证的突变株进行了 DNA印迹杂交实验，实验步骤与文献相同(J Microb1l Methods2012;89:201-8)，结果显示只有一个插入条带的突变株即为最终目标突变菌株。最终目标突变菌株的数量与总突变株的数量的比值为敲除特异性。之前报道中获得的突变株H10::MspI297s 和 HlOApyrF::CipC117a 作为 DNA 印迹杂交实验的对照(J Microb1lMethods 2012;89:201-8; Appl Microb1l B1techno1 2014;98:313-23)。
[0055]结果显示，尽管之前报道中的ClosTron系统具有更高的敲除效率(J Microb1lMethods 2012; 89:201-8)，但是其脱靶效率在mspl和cipC两个敲除基因中都为100%。使用诱导型ClosTron系统进行基因敲除，不管有没有L-阿拉伯糖的诱导，菌株ΗΙΟΛ/^if Λ??/?/都没有发现脱靶现象(图10Α)。而对于菌株ΗΙΟΛ/^#没有在含有红霉素的培养基中传代时，其脱靶效率为0-33%;而当其在含有红霉素的培养基中传代时，所有的菌株都为多插入菌株(脱靶效率为100%)(图10B)。以上结果说明利用诱导型ClosTron系统可以明显降低脱靶效率，获得较高的敲除特异性。
[0056]实施例12.热纤梭菌的电转化
根据文献(PloS One.2013;8: e69032)报道，转化方法为:热纤梭菌菌体在100 mLGS-2液体培养基中55°C条件下生长到0D600=0.5-0.8，3000g，10分钟离心收集菌体，使用电转缓冲液(15%甘油)洗2次后定容到lmL，取60 μ L菌液与1 μ g质粒混合放入0.lcm电转杯进行电击。电转仪参数设置为:电压1500V，频率2000，占空比10%，电击次数40。电转化后的菌液加入到5mL新鲜的GS-2培养基中，51°C复苏培养6小时。复苏后的菌体经离心涂布于含有甲砜氯霉素抗生素的GS-2固体平板上，在51°C厌氧条件下培养，直至长出菌落(约5-7天)。该菌落即为阳性转化子。
[0057]实施例13.厌氧荧光蛋白PpFbFPm在热纤梭菌中的诱导表达
将质粒pPTK-PpFbFPm或pARA-PpFbFPm转化进入热纤梭菌DSM1313菌株中，转化方法同实施例 12。转化子 DSM1313::pARA-PpFbFPm 或 DSM1313::pPTK_PpFbFPm 在添加或不添加L-阿拉伯糖的培养基中培养，PpFbFPm的胞内表达通过绿色荧光成像来检测。不管是否有L-阿拉伯糖，转化子DSM1313::pPTK-PpFbFPm都能观察到强烈的荧光，证明来源于丙酮丁醇梭菌的磷酸转酮酶启动子不会被热纤梭菌内源的蛋白所识别和干扰。与之相反，DSM1313::pARA-PpFbFPm在没有L-阿拉伯糖诱导时不会产生绿色荧光，说明araR是抑制子而不是激活子。在添加有5g/L L-阿拉伯糖时，DSM1313::pARA-PpFbFPm细胞产生的绿色荧光强度与DSM1313:: pPTK-PpFbFPm相似，说明L-阿拉伯糖可以强烈的诱导PpFbFPm在热纤梭菌中的表达。以上结果显示阿拉伯糖诱导系统能够很好的控制目标蛋白在热纤梭菌中的表达。
[0058]实施例14.厌氧荧光蛋白PpFbFPm在粪堆梭菌中的诱导表达
将质粒pPTK-PpFbFPm或pARA-PpFbFPm转化进入粪堆梭菌中，方法同实施例12。转化子在添加或不添加L-阿拉伯糖的培养基中培养，PpFbFPm的胞内表达通过绿色荧光成像来检测。不管是否有L-阿拉伯糖，携带有pPTK-PpFbFPm的转化子都能观察到强烈的荧光，证明来源于丙酮丁醇梭菌的磷酸转酮酶启动子不会被粪堆梭菌内源的蛋白所识别和干扰。与之相反，携带有pARA-PpFbFPm的转化子在没有L-阿拉伯糖诱导时不会产生绿色荧光，说明araR是抑制子而不是激活子。在添加有5g/L L-阿拉伯糖时,携带有pARA-PpFbFPm的转化子产生的绿色荧光强度与含有pPTK-PpFbFPm的转化子相似，说明L-阿拉伯糖可以强烈的诱导PpFbFPm在粪堆梭菌中的表达。以上结果显示阿拉伯糖诱导系统能够很好的控制目标蛋白在粪堆梭菌中的表达。
【主权项】
1.一种L-阿拉伯糖诱导的启动子，其特征在于:该启动子的核苷酸序列是序列表SEQID NO: 2所示的序列。2.含有权利要求1中所述启动子的重组载体、表达盒或重组菌。3.—种微生物的可诱导基因表达调控系统，其特征在于:包括诱导剂L-阿拉伯糖、序列表SEQ ID NO: 1的反馈抑制蛋白AraR和具有反馈抑制蛋白AraR结合位点的启动子Para;所述启动子Para的序列表为SEQ ID NO: 2。4.根据权利要求3所述的一种微生物的可诱导基因表达调控系统，其特征在于:所述微生物为梭菌属。5.根据权利要求4所述的一种微生物的可诱导基因表达调控系统，其特征在于:所述梭菌属包括解纤维梭菌、丙酮丁醇梭菌、热纤梭菌或粪堆梭菌。6.一种微生物的反向基因筛选系统，其特征在于:包括诱导剂L-阿拉伯糖、序列表SEQID NO: 1的反馈抑制蛋白AraR、具有反馈抑制蛋白结合位点的启动子元件Para以及毒性基因；所述启动子PaM的序列表为SEQ ID NO: 2 ;所述毒性基因为mazF基因、pyrF基因、hpt基因、tdk基因、codA基因、sacB基因和galK基因中的一个或多个。7.根据权利要求6所述的一种微生物的反向基因筛选系统，其特征在于:所述微生物为梭菌属。8.根据权利要求7所述的一种微生物的反向基因筛选系统，其特征在于:所述梭菌属包括解纤维梭菌、丙酮丁醇梭菌、热纤梭菌或粪堆梭菌。9.一种降低基于二类内含子的基因靶向操作技术的脱靶率的方法，其特征在于:以L-阿拉伯糖为诱导剂，利用反馈抑制蛋白AraR和具有反馈抑制蛋白结合位点的启动子元件Para，对二类内含子元件进行可控诱导表达。10.根据权利要求9所述的一种降低基于二类内含子的基因靶向操作技术的脱靶率的方法，其特征在于:所述基于二类内含子革巴向操作技术包括Clostron、Targetron或Thermotargetron□
【专利摘要】本发明的目的在于提供一种诱导型启动子、基于该启动子的基因诱导表达调控系统、以及基于该表达调控系统开发的改良微生物遗传操作工具。采用L-阿拉伯糖为诱导剂，阿拉伯糖是一种自然界普遍存在的碳源，对细胞生长无抑制作用。该诱导表达系统能够使基因表达水平上调最高达到800倍，且具有较好的严谨性，可以用于梭菌属或其它微生物细胞中目标基因的可控表达，以及用于现有遗传改造技术的优化及新工具的开发。
【IPC分类】C12N15/113, C12N15/63
【公开号】CN105483128
【申请号】CN201410476748
【发明人】崔球, 张 杰, 刘亚君, 崔古贞
【申请人】中国科学院青岛生物能源与过程研究所
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2014年9月18日