A和SDA。"多不饱和"脂肪酸包含多于一个双键，并且双键以一种亚 甲基间断的系统(-CH=CH-CH 2-CH=CH-)排列。
[0062] 本文中通过一种编号系统描述脂肪酸，在该编号系统中，冒号前的数字指示所述 脂肪酸中碳原子的数目，而冒号后的数字是存在双键的数目。在不饱和脂肪酸的情况下，随 后是圆括号内的数字，指示双键的位置。圆括号内的每个数字是双键连接的两个碳原子中 编号较低的碳原子。例如，油酸可以描述为18:1(9)，亚油酸可以描述为18:2(9,12)，这些编 号指出有18个碳原子，一种在碳原子9有一个双键，另一种在碳原子9和12有两个双键。
[0063] 生产不饱和脂肪酸（即不饱和脂肪酸生物合成途径）中的控制步骤由膜结合的脂 肪酸去饱和酶(如Fad4、Fad5、Fad5_2和/或Fad6)催化。明确地说，所述酶催化脂肪酸分子碳 原子间双键的形成。本文所用术语"不饱和脂肪酸生物合成途径"指在体内或体外导致不饱 和脂肪酸合成的一系列化学反应。所述途径包括一系列去饱和以及延长步骤，产生不饱和 脂肪酸，并最终产生长链多不饱和脂肪酸。所述不饱和脂肪酸可以包括:GLA 18: 3(6,9， 12)、SDA 18:4(6,9，12，15)、AA 20:4(5,8，11，14)、EPA 20:5(5,8，11，14，17WPDPA22:5 (4,7，10,13,16)以及DHA 22:6(4,7,10,13,16,19)。
[0064] 去饱和酶可以包括一个血红素结合基序和/或约三个保守组氨酸基序，不过可以 存在其它结构域。脂肪酸去饱和酶家族的成员转化饱和脂肪酸成为不饱和脂肪酸，即长链 多不饱和脂肪酸(LCPUFA)，长链多不饱和脂肪酸是哺乳动物体内各种组织和细胞器(神经、 视网膜、脑和免疫细胞）的细胞膜的组成成分。LCPUFA的例子其中包括二十二碳六烯酸 (DHA，22:6(4,7，10,13,16,19))。临床研究已经显示:DHA对于婴儿脑部的生长和发育以及 维持成人正常脑功能是必需的（]^竹丨1^七2，]\1.(1992)夂？6乜3廿.120:5129-5138)。0骱对于 涉及信号传导过程、视紫红质激活以及视杆细胞和视锥发育的感光细胞功能也有显著影响 (6;[1181:0，1^.]\1.等（2000)?1'〇8.1^口丨(11^8.39:315-391)。此外，在如高血压、关节炎、动脉粥 状硬化、抑郁、血栓形成和癌症等疾病的治疗中也发现DHA的一些积极效应(H 〇rr〇Cks，L.A. 和Yeo，Y.K.( 1999)Pharmacol. Res. 40: 211-215)。因此，去饱和酶分子可以用于生产在治疗 疾病中应用的LCPUFA，所述疾病的特征在于异常调节性生长、增殖或分化。所述疾病包括癌 症，如癌、肉瘤或白血病;肿瘤血管发生和转移;骨骼发育异常;肝病;脊髓发育不良综合征； 以及造血疾病和/或骨髓增生疾病。其它与血管发生有关并因此与去饱和酶有关的疾病包 括 1 型遗传性出血性毛细管扩张 (hereditary hemorrhagic telangiectasia type 1)、进 行性纤维发育不良骨化、特发性肺纤维变性和Klippel-Trenaunay-Weber综合征。
[0065]术语"家族"当指本发明的蛋白和核酸分子时，意味着具有共同结构域或基序并具 有本文定义的足够氨基酸序列或核苷酸序列同源性的两种或多种蛋白或核酸分子。所述家 族成员可以是天然的或非天然的，并且可以来自同一物种或不同物种。例如，一个家族可以 包括人类来源的第一种蛋白和人类来源的其它不同蛋白，或者可以包括非人类来源的类似 物(如大鼠或小鼠蛋白）。一个家族的成员也可以具有共同的功能特性。
[0066]例如，本发明的去饱和酶蛋白家族包括一个细胞色素 b5血红素结合基序。本文所 用术语"血红素结合基序"是在前端去饱和酶中存在的细胞色素 b5样结构域的N末端延伸结 构。
[0067]在另一实施方案中，蛋白的去饱和酶家族的成员在蛋白中包括"组氨酸基序"，最 好包括约三个或四个组氨酸基序。本文所用术语"组氨酸基序"包括具有至少约两个组氨酸 残基、最好约三个或四个组氨酸残基的蛋白结构域，并且一般在所有微粒体去饱和酶中作 为第三个保守组氨酸基序出现。
[0068] 细胞色素 b5血红素结合基序和组氨酸基序的例子包括SEQ ID N0: 2的氨基酸残基 41-44、182-186、216-223和453-462，SEQIDN0:4的氨基酸残基40-43、171-175、207-213和 375-384，SEQ ID N0:6的氨基酸残基40-45、171-176、208-213和395-400，SEQ ID N0:8的氨 基酸残基42-47、178-183、215-220 和400-405,如图 3 和6所示。
[0069]本发明的分离的去饱和酶蛋白具有与SEQ ID N0:2、4、6和8的氨基酸序列足够同 源的氨基酸序列，或者由与SEQ ID N0:1、3、5或7足够同源的核苷酸序列编码。本文所用术 语"足够同源"指第一种氨基酸序列或核苷酸序列具有与第二种氨基酸序列或核苷酸序列 足够或最小数目的相同或同等(如具有相似侧链的氨基酸残基)氨基酸残基或核苷酸，使得 所述第一种和第二种氨基酸序列或核苷酸序列具有共同结构域或基序和/或共同功能活 性。例如，本文定义下面这样的氨基酸或核苷酸序列是足够同源的:所述氨基酸序列或核苷 酸序列具有共有结构域并包含至少一个、最好两个结构域或基序，其中所述序列的共有结 构域在所述结构域的氨基酸序列上具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、 85%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的同源性或同一性。此外，本文定义下 面这样的氨基酸或核苷酸序列是足够同源的：所述氨基酸序列或核苷酸序列具有至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或 更高的同源性或同一性，并且具有共有功能活性。
[0070]在一个优选实施方案中，去饱和酶蛋白包括至少一种或多种下面结构域或基序： 血红素结合基序和/或组氨酸基序，并且所述去饱和酶蛋白的氨基酸序列与SEQ ID N0: 2、 4、6或8 的氨基酸序列具有至少约 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、85%、 90%、95 %、96 %、97 %、98 %、99 %或更高的同源性或同一性。在又一优选实施方案中，去饱 和酶蛋白包括至少一种或多种下面结构域:血红素结合基序和/或组氨酸基序，并且由具有 以下核苷酸序列的核酸分子编码，所述核苷酸序列在严格杂交条件下与包含SEQ ID N0:1、 3、5或7的核苷酸序列的核酸分子互补物杂交。在再一实施方案中，去饱和酶蛋白包括至少 一个血红素结合基序和/或至少约三个组氨酸基序，并且具有去饱和酶活性。
[0071 ]在本文中"去饱和酶活性"、"去饱和酶的生物活性"或"去饱和酶的功能活性"可以 互换使用，这些术语包括根据标准技术在体内或体外测定，由去饱和酶蛋白、多肽或核酸分 子在去饱和酶效应细胞或去饱和酶底物上施加或介导的活性。在一个实施方案中，去饱和 酶活性是直接活性，例如与去饱和酶的靶分子结合。本文所用的"靶分子"或"结合配偶体" 是一种分子，如涉及不饱和脂肪酸(如中间体脂肪酸)合成的分子，去饱和酶蛋白天然能够 与所述分子结合或相互作用，完成去饱和酶介导的功能。去饱和酶的直接活性还包括在脂 肪酸分子的碳原子之间形成双键，以形成不饱和脂肪酸分子。
[0072] 分离的破囊壶菌属菌Δ 4去饱和酶Fad4的核苷酸序列、cDNA以及由Fad4cDNA编码 的预期氨基酸序列分别显示于图1和SEQ ID NO: 1和2。破囊壶菌属菌Fad4基因（可读框)约 1560个核苷酸长，编码一种分子量约为59. lkD、长约519个氨基酸残基的蛋白。
[0073] 破囊壶菌属菌Δ 5去饱和酶Fad5的核苷酸序列、cDNA以及由Fad4cDNA编码的预期 氨基酸序列分别显示于图2和SEQ ID N0:3和4。破囊壶菌属菌Fad5基因约1320个核苷酸长， 编码一种分子量约为49.8kD、长约456个氨基酸残基的蛋白。
[0074] 畸雌腐霉Δ 5去饱和酶Fad5_2的核苷酸序列、cDNA以及由Fad5_2cDNA编码的预期 氨基酸序列分别显示于图4和SEQ ID N0:5和6。畸雌腐霉Fad5-2基因约1371个核苷酸长，编 码一种长约456个氨基酸残基的蛋白。
[0075] 畸雌腐霉Δ 6去饱和酶Fad6的核苷酸序列、cDNA以及由Fad6cDNA编码的预期氨基 酸序列分别显示于图5和SEQ ID N0:7和8。畸雌腐霉Fad6基因约1383个核苷酸长，编码一种 长约460个氨基酸残基的蛋白。
[0076]本发明的各方面将在下面的小节中进一步详细描述：
[0077] I.分离的核酸分子
[0078] 本发明的一个方面涉及编码去饱和酶蛋白或其生物活性部分的分离的核酸分子、 足以用作鉴定编码去饱和酶的核酸分子(如去饱和酶mRNA)的杂交探针的核酸片段、以及用 作PCR引物以扩增或突变去饱和酶核酸分子的片段。本文所用术语"核酸分子"包括DNA分子 (如cDNA或基因组DNA)和RNA分子(如mRNA)以及使用核苷酸类似物产生的DNA或RNA类似物。 所述核酸分子可以是单链或双链的，但最好是双链DNA。
[0079] 术语"分离的核酸分子"包括这样的核酸分子:所述核酸分子与其天然来源中存在 的其它核酸分子分离。例如，在基因组DNA的情况下，术语"分离的"包括这样的核酸分子:所 述核酸分子与所述基因组DNA天然结合的染色体分离。"分离的"核酸最好不含获得所述核 酸分子的生物的基因组DNA中所述核酸侧翼的序列（即在所述核酸5'和3'末端的序列）。例 如，在不同实施方案中，所述分离的去饱和酶核酸可以包含获得所述核酸的细胞基因组DNA 中天然出现在所述核酸分子侧翼的少于约5kb、4kb、3kb、2kb、lkb、0.5kb或0. lkb的核苷酸 序列。此外，"分离的"核酸分子(如cDNA分子)可以基本不含其它细胞物质，或者在用重组技 术生产的情况下不含培养基，或者在化学合成的情况下基本不含化学前体或其它化学物 质。
[0080] 可以使用标准分子生物学技术和本文提供的序列信息分离本发明的核酸分子，所 述核酸分子例如具有SEQ ID N0:l、3、5、7的核苷酸序列或其部分的核酸分子。用SEQ ID NO: 1、3、5或7的核苷酸序列的全部或部分作为杂交探针，可以使用标准杂交和克隆技术(如 下面文献所述：5&111131'〇〇1<:，了.等]\1〇16(3111&1'(]1〇11；[1^:八1^13(^&1:0^]\^11皿1.第二版，〇〇1(1 Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor, NY ,1989)分离去饱和酶核酸分子。
[0081 ]此外，使用根据SEQ ID NO: 1、3、5或7的序列设计的合成寡核苷酸引物，通过聚合 酶链反应(PCR)可以分离包含SEQ ID N0:l、3、5或7的全部或部分的核酸分子。
[0082]使用cDNA、mRNA或者基因组DNA作为模板以及合适的寡核苷酸引物，根据PCR扩增 技术，可以扩增本发明的核酸。可以将如此扩增的核酸克隆进合适载体并通过DNA序列分析 进行鉴定。此外，可以通过标准合成技术(如使用自动化DNA合成仪)制备对应于去饱和酶核 苷酸序列的寡核苷酸。
[0083]在另一实施方案中，所述核酸分子包括SEQ ID N0:1、3、5或7陈述的核苷酸序列。 [0084]在又一实施方案中，本发明的分离的核酸分子包含核酸分子，所述核酸分子是SEQ ID NO: 1、3、5或7所示核苷酸序列或者任何一种上述核苷酸序列的一部分的互补物。与SEQ ID N0:l、3、5或7所示核苷酸序列互补的核酸分子是与SEQ ID N0:l、3、5或7所示的核苷酸 序列足够互补的核酸分子，以便它能够与SEQ ID N0:1、3、5或7所示的核苷酸序列杂交，由 此形成稳定的双链体。
[0085]在再一实施方案中，本发明的分离的核酸分子包括与SEQ ID N0:1、3、5或7所不核 苷酸序列（例如完整长度的所述核苷酸序列）或者任何一种上述核苷酸序列的一部分或互 补物有至少约 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、 99%或更高同一性的核苷酸序列。在一个实施方案中，本发明的核酸分子包含一段核苷酸 序列，所述核苷酸序列长至少（或不多于）50-100、100-250、250-500、500-750、750-1000、 1000-1250、1250-1500、1500-1750、1750-2000、2000-2250、2250-2500、2500-2750、2750-3000、3250-3500、3500-3750或更多个核苷酸，并且在严格杂交条件下与SEQ ID N0:l、3、5 或7的核酸分子的互补物杂交。
[0086] 此外，本发明的核酸分子可以仅包含SEQ ID N0:1、3、5或7的部分核酸序列，例如 可以用作探针或引物的片段或编码部分去饱和酶蛋白的片段，如去饱和酶蛋白的生物活性 部分。根据克隆所述去饱和酶基因确定的核苷酸序列允许产生探针和引物，所述探针和引 物设计用于鉴定和/或克隆其它去饱和酶家族成员以及其它物种的去饱和酶类似物。所述 探针/引物(如寡核苷酸)一般包括基本纯化的寡核苷酸。所述寡核苷酸一般包括在严格条 件下与下面序列杂交的核苷酸序列区：SEQ ID N0:l、3、5或7的有义链或SEQ ID N0:l、3、5 或7的反义链或SEQ ID NO: 1、3、5或7的天然等位基因变异体或突变异体的至少约12或15、 优选约20或25、更优选约30、35、40、45、50、55、60、65或75个连续核苷酸。
[0087] 示例性的探针或引物长至少（或不高于）为12或15、20或25、30、35、40、45、50、55、 60、65、70、75或更多核苷酸，和/或包含本文所述分离的核酸分子的连续核苷酸。本发明的 范围内还包括下述探针和引物，所述探针或引物包含本文所述分离的核酸分子的连续核苷 酸，但在所述探针或引物序列内有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个碱基的差异。基于所述去饱和 酶核苷酸序列的探针可以用于检测（如特异性检测）编码同样或同源蛋白的转录物或基因 组序列。在优选实施方案中，所述探针还包括与其连接的标记基团，如所述标记基团可以是 放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子。在另一实施方案中，提供一组引物，如适于在 PCR中应用的引物，所述引物可以用于扩增去饱和酶序列的选定区，所述区如本文所述的结 构域、区、位点或其它序列。所述引物应该至少长5、10或50碱基对，并且少于100碱基对，或 者少于200碱基对。所述引物在与本文所述序列或天然出现变异体的序列进行比较时，应该 相同，或者差异不大于1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个碱基。所述探针可以用作诊断测定试剂盒 的一部分，以鉴定错误表达去饱和酶蛋白的细胞或组织，例如通过测量来自受试验者的细 胞样品中编码去饱和酶的核酸，如检测去饱和酶mRNA水平或测定基因组去饱和酶基因是否 已经突变或缺失。
[0088]可以如下制备编码"去饱和酶蛋白生物活性部分"的核酸片段:分离SEQ ID N0:1、 3、5或7的核苷酸序列部分，该部分编码具有去饱和酶生物活性的多肽(所述去饱和酶蛋白 的生物活性如本文所述），然后表达所编码的部分去饱和酶蛋白（如通过体外重组表达），随 后评价所编码的部分去饱和酶蛋白的活性。在一个示例性的实施方案中，所述核酸分子至 少长 50-100、100-250、250-500、500-700、750-1000、1000-1250、1250-1500、1500-1750、 1750-2000、2000-2250、2250-2500、2500-2750、2750-3000、3250-3500、3500-3750或更多核 苷酸，并且编码具有去饱和酶活性(如本文所述)的蛋白。
[0089] 本发明还包括这样的核酸分子:所述核酸分子由于遗传密码的简并性与SEQ ID NO: 1、3、5或7的核苷酸序列不同，因此它们编码的去饱和酶蛋白与SEQ ID NO: 1、3、5或7所 示核苷酸序列编码的去饱和酶蛋白相同。在另一实施方案中，本发明的分离的核酸分子具 有编码蛋白的核苷酸序列，所述蛋白的氨基酸序列与SEQ ID N0: 2、4、6或8所示的氨基酸序 列有至少1个、但不多于5个、10个、20个、50个或100个氨基酸残基不同。在又一实施方案中， 所述核酸分子编码人去饱和酶的氨基酸序列。假如需要进行对比排列，则排列序列的最大 同一 ,性。
[0090] 核酸变异体可以是天然的或非天然的，天然变异体例如等位基因变异体(相同座 位）、同系物(不同座位)和直向同源物(orthologue)(不同生物）。可以通过诱变技术制造非 天然出现的变异体，所述诱变技术包括那些应用于多核苷酸、细胞或生物的技术。所述变异 体可以包括核苷酸置换、缺失、倒位和插入。变异可以出现在编码区或非编码区，或者同时 出现在编码区和非编码区。所述变异可以产生保守氨基酸取代和非保守氨基酸取代(所编 码产物的比较）。
[0091 ] 等位基因变异体源于，例如，群体(如人类群体）内的DNA序列多态性，所述DNA序列 多态性导致所述去饱和酶蛋白的氨基酸序列的变化。去饱和酶基因内的所述遗传多态性可 以由于天然等位基因变异而存在于群体的个体内。
[0092] 本文所用的术语"基因"和"重组基因"指这样的核酸分子:所述核酸分子包括编码 去饱和酶蛋白（如油籽去饱和酶蛋白）的可读框，并且可以还包括非编码的调节序列和内含 子。
[0093] 因此，在一个实施方案中，本发明提供分离的核酸分子，所述分离的核酸分子编码 多肽的天然出现的等位基因变异体，所述多肽包含SEQ ID N0: 2、4、6或8的氨基酸序列，其 中所述核酸分子在例如严格杂交条件下与包含SEQ ID N0:1、3、5或7的核酸分子的互补物 杂交。
[0094] 去饱和酶的等位基因变异体(如Fad4、Fad5、Fad5_2或Fad6)包括有功能的或无功 能的去饱和酶蛋白。有功能的等位基因变异体是去饱和酶蛋白天然出现的氨基酸序列变异 体，所述变异体保持下面能力，如：（i)与去饱和酶底物或靶分子(如脂肪酸如22:5(n-3))相 互作用;和/或（ii)在去饱和酶底物或靶分子的碳原子之间形成双键。由本发明的核酸和蛋 白分子生产的脂肪酸也可用于治疗疾病如衰老、应激、糖尿病、癌症、炎症性疾病（如关节 炎、湿疹)和心血管疾病。有功能的等位基因变异体一般将仅包含SEQ ID NO:2、4、6或8的一 个或多个氨基酸的保守取代，或包含所述蛋白非关键区中非关键残基的取代、缺失或插入。
[0095] 无功能的等位基因变异体是所述去饱和酶蛋白天然出现的氨基酸序列变异体(如 Fad4、Fad5、Fad5_2或Fad6)，所述变异体不具有下面能力，如：（i)与去饱和酶底物或靶分子 (如中间体脂肪酸如22:5(n-3))相互作用;和/或（ii)在去饱和酶底物或靶分子的碳原子之 间形成双键。无功能的等位基因变异体一般将包含SEQ ID N0:2、4、6或8的氨基酸序列中的 非保守取代、缺失或插入，或者成熟前切短所述序列，或者包含在所述蛋白关键区或关键残 基的取代、插入或缺失。
[0096] 本发明还提供直向同源物(如所述去饱和酶蛋白的人直向同源物）。破囊壶菌属和 畸雌腐霉去饱和酶蛋白的直向同源物是从其它生物分离的蛋白，并具有同样的去饱和酶底 物或靶分子结合机制、双键形成机制、对婴儿脑部生长和发育的调节机制、对成人正常脑功 能的维持机制、影响涉及信号转导过程的感光功能的能力、影响视紫红质激活的能力、视杆 细胞和/或视锥的发育机制、和/或对非人去饱和酶蛋白的细胞生长和/或增殖的调节机制。 破囊壶菌属和畸雌腐霉去饱和酶蛋白的直向同源物可以容易地鉴定为包含与SEQ ID N0: 2、 4、6或8基本同源的氨基酸序列。
[0097]此外，本发明的范围内包括编码其它去饱和酶家族成员、并因此与SEQ ID N0:1、 3、 5或7的去饱和酶序列不同的核苷酸序列的核酸分子。例如，可以根据Fad4、Fad5、Fad5-2 或Fad6的核苷酸序列鉴定另一种去饱和酶cDNA。此外，本发明的范围内包括编码不同物种 的去饱和酶、并因此与SEQ ID NO: 1、3、5或7的去饱和酶序列不同的核苷酸序列的核酸分 子。例如，可以根据Fad4、Fad5、Fad5_2或Fad6的核苷酸序列