鉴定SchizochytriumS 0丫1:116(3〇(1;[11；[111]1的去饱和酶〇0嫩。
[0098] 可以使用本文公开的cDNA或其部分作为杂交探针，依照标准杂交技术，在严格杂 交条件下根据对应于本发明去饱和酶cDNA天然等位基因变异体和同系物的核酸分子与本 文公开的去饱和酶核酸的同一性，分离所述变异体和同系物。
[0099] 可以使用本领域内已知的方法(如在严格杂交条件下与本发明的分离的核酸分子 杂交），鉴定orhtologue、同系物和等位基因变异体。在一个实施方案中，本发明的分离的核 酸分子至少长15、20、25、30或更多个核苷酸，并在严格条件下与包含SEQ ID N0:l、3、5或7 的核苷酸序列的核酸分子杂交。在其它实施方案中，所述核酸至少长50-100、100_250、250-500、500-700、750-1000、1000-1250、1250-1500、1500-1750、1750-2000、2000-2250、2250-2500、2500-2750、2750-3000、3250-3500、3500-3750或更多核苷酸。
[0100] 本文所用术语"在严格条件下杂交"用于描述如下杂交和洗涤条件:在所述条件下 相互之间显著相同或同源的核苷酸序列保持相互杂交。所述条件最好是这样的条件:在所 述条件下，相互之间至少约70%相同、更优选至少约80%相同、甚至更优选至少约85%相同 或90%相同的序列保持相互杂交。所述严格条件是本领域内技术人员已知的，可以在下面 文献中找到：Current Protocols in Molecular Biology,Ausubel等编辑，John Wiley& Sons，Inc. (1995)，第2、4和6部分。其它严格条件可以在Molecular Cloning:A LaboratoryManual，Sambrook等，Cold Spring Harbor Press , Cold Spring Harbor,NY (1989)，第7、9和11章中找到。严格杂交条件一个优选、非限制性的实施例包括在约65-70°C 下在4X氯化钠/柠檬酸钠（SSC)中杂交(或者在42-50°C下在4X SSC加50 %甲酰胺中杂交）， 然后在约65-70°C下在IX SSC中洗涤一次或多次。高度严格杂交条件一个优选非限制性的 例子包括在约65-70°C下在IX SSC中杂交（或者在42-50°C下在IX SSC加50%甲酰胺中杂 交），然后在约65-70°C下在0.3X SSC中洗涤一次或多次。较低严格杂交条件一个优选非限 制性的例子包括在约50_60°C下在4X SSC中杂交(或者在40-45°C下在6X SSC加50%甲酰胺 中杂交），然后在约50_60°C下在2X SSC中洗涤一次或多次。本发明也包括上述值的中间范 围值(如在65-70°C或在42-50°C)。在杂交缓冲液和洗涤缓冲液中可以使用SSPE(lxSSPE是 0.15M NaCl，10mM NaH2P〇4和 1.25mM EDTA，pH 7.4)替代SSC(1X SSC是0.15MNaCl和 15mM柠 檬酸钠）；完成杂交后每次洗涤进行15分钟。预期长度少于50个碱基对的杂交体的杂交温度 应该比杂交体的熔解温度(Tm)低5-10°C，而Tm根据下面方程确定。对于长度少于18个碱基 对的杂交体，Tm(°C) = 2 (A+T碱基的数量)+4 (G+C碱基的数量）。对于长度在18到49个碱基对 之间的杂交体，!'111(°〇=81.5+16.6(1(^1()[他 +])+0.41(%6+〇-(600/^)，其中~是所述杂交 体中碱基的数量，[Na+]是杂交缓冲液中钠离子的浓度（IX SSC的[Na+]=0.165M)。技术人员 将理解:在杂交缓冲液和/或洗涤缓冲液中可以加入其它试剂，以降低核酸分子与膜(例如 硝酸纤维素膜或尼龙膜）的非特异性结合，所述试剂包括但不限于封闭剂(如BSA或鲑鱼或 鲱鱼精子载体DNA)、去污剂（如SDS)、鳌合剂（如EDTA)、Ficoll、PVP等。当使用尼龙膜时，特 别地，严格杂交条件另一个优选非限制性的例子是在约65°C下在0.25-0.5M NaH2P〇4,7% SDS中杂交，然后在65°C下在0 · 02M NaH2P〇4，1 % SDS中（见如Church和Gi lbert (1984) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:1991-1995)或0.2X SSC, 1%SDS洗涤一次或多次。
[0101] 在严格条件下与SEQ ID NO: 1、3、5或7的序列杂交的本发明分离的核酸分子最好 对应于天然存在核酸分子。本文所用的"天然出现的"核酸分子指具有天然出现的核苷酸序 列（如编码天然蛋白）的RNA或DNA分子。
[0102] 技术人员还将理解:除可能在群体中存在的所述去饱和酶序列的天然出现的等位 基因变异体外，可以通过突变在SEQ ID N0:1、3、5或7的核苷酸序列中引入变化，由此导致 所编码的去饱和酶蛋白的氨基酸序列的变化，同时不改变所述去饱和酶蛋白的功能能力。 例如，在SEQ ID N0:1、3、5或7的序列中可以制造导致在"非必需"氨基酸残基发生氨基酸取 代的核苷酸置换。"非必需"氨基酸残基是Fad4、Fad5、Fad5-2或Fad6的野生型序列（如SEQ ID N0: 2、5、8或11)可以变化但不改变生物活性的残基，而"必需"氨基酸残基是生物活性所 需的。例如，在本发明去饱和酶蛋白中保守的氨基酸残基(如在血红素结合基序或组氨酸基 序中存在的那些氨基酸残基)预期将特别不能承受改变。此外，在本发明的去饱和酶蛋白和 脂肪酸去饱和酶家族其它成员间保守的其它氨基酸残基不可能可以承受改变。
[0103] 因此，本发明的另一方面涉及编码去饱和酶蛋白的核酸分子，所述去饱和酶蛋白 对于活性并非必需的氨基酸残基中包含变化。所述去饱和酶蛋白的氨基酸序列与SEQ ID N0:2、4、6或8不同，但保持生物活性。在一个实施方案中，所述分离的核酸分子包括编码蛋 白的核苷酸序列，其中所述蛋白包括与SEQ ID N0:2、4、6或8(如SEQ ID N0:2、4、6或8的全 长)有至少约 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、 99%或更高同一性的氨基酸序列。
[0104] 可以如下制造编码与SEQ ID N0:2、4、6或8的蛋白同源的去饱和酶蛋白的分离的 核酸分子:在SEQ ID N0:1、3、5或7的核苷酸序列中引入一个或多个核苷酸置换、添加或缺 失，以便在所编码的蛋白中引入一个或多个氨基酸取代、添加或缺失。可以通过标准技术将 突变引入SEQ ID NO: 1、3、5或7,所述标准技术如定点诱变和PCR介导的诱变。最好在一个或 多个预期非必需氨基酸残基上制造保守氨基酸取代。"保守氨基酸取代"是其中用具有相似 侧链的氨基酸残基替换氨基酸残基的取代。本领域内已经定义具有相似侧链的氨基酸残基 家族。这些家族包括:具有碱性侧链的氨基酸(如赖氨酸、精氨酸、组氨酸）、具有酸性侧链的 氨基酸(如天冬氨酸、谷氨酸）、具有无电荷极性侧链的氨基酸(如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰 胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸）、具有非极性侧链的氨基酸(如丙氨酸、缬氨 酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸）、具有β分支侧链的氨基酸(如苏氨酸、 缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香侧链的氨基酸(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸）。因此， 最好用来自相同侧链家族的另一氨基酸残基取代所述去饱和酶蛋白中预期非必需氨基酸 残基。或者，在另一实施方案中，可以例如通过饱和诱变在去饱和酶编码序列的全部或部分 内随机引入突变，然后可以筛选所得突变异体的去饱和酶活性，以鉴定保持活性的突变异 体。对SEQ ID NO: 1、3、5或7进行诱变后，可以重组表达所编码的蛋白，并测定所述蛋白的活 性。
[0105]在一个优选实施方案中，可以测定突变去饱和酶蛋白的下列能力：（i)与去饱和酶 底物或靶分子(如中间体脂肪酸)相互作用；和/或（ii)在去饱和酶底物或靶分子的碳原子 之间形成双键。
[0106] II.分离的去饱和酶蛋白
[0107] 本发明的一方面涉及分离或重组的去饱和酶蛋白和多肽以及其生物活性部分。在 一个实施方案中，可以使用标准蛋白纯化技术，通过合适的纯化方案从细胞或组织来源分 离天然去饱和酶蛋白。在另一实施方案中，通过重组DNA技术产生去饱和酶蛋白。作为重组 表达的替代方法，可以使用标准肽合成技术化学合成去饱和酶蛋白或多肽。
[0108] "分离的"或"纯化的"蛋白或其生物活性部分基本不含来自获得所述去饱和酶蛋 白的细胞或组织来源的细胞物质或其它污染蛋白，或当使用化学合成时基本不含化学前体 或其它化学试剂。语言"基本不含细胞物质"包括下述去饱和酶蛋白制品，其中所述蛋白与 其由之分离或重组产生的细胞的细胞成分分离。在一个实施方案中，语言"基本不含细胞物 质"包括这样的去饱和酶蛋白制备物：所述去饱和酶蛋白制备物含有少于约80%、70%、 60 %、50 %、40 %或30 % (干重）的非去饱和酶蛋白（本文也称为"污染蛋白"）、更优选少于约 20%的非去饱和酶蛋白、更优选少于约10%的非去饱和酶蛋白、最优选少于约5%非去饱和 酶蛋白。当重组产生所述去饱和酶蛋白或其生物活性部分时，它也最好基本不含培养基，即 培养基占所述蛋白制备物量少于约20%、更优选少于约10%、最优选少于约5%。
[0109] 语言"基本不含化学前体或其它化学试剂"包括这样的去饱和酶蛋白制备物:所述 制备物中所述蛋白与涉及所述蛋白合成的化学前体或其它化学试剂分离。在一个实施方案 中，语言"基本不含化学前体或其它化学试剂"包括这样的去饱和酶蛋白制备物:所述制备 物具有少于约30% (干重）的化学前体或非去饱和酶化学试剂，更优选少于约20%化学前体 或非去饱和酶化学试剂，甚至更优选少于约10%化学前体或非去饱和酶化学试剂，最优选 少于约5%化学前体或非去饱和酶化学试剂。应当理解，本发明的蛋白也可以采取与它们对 应天然蛋白不同的形式，和/或采取仍然与至少一些细胞成分结合的形式。例如，所述蛋白 可以结合细胞膜。
[0110] 本文所用的去饱和酶蛋白的"生物活性部分"包括去饱和酶蛋白的片段，所述片段 参与去饱和酶分子和非去饱和酶分子(如去饱和酶底物如脂肪酸）间的相互作用。去饱和酶 蛋白的生物活性部分包括这样的肽:所述肽包含与所述去饱和酶氨基酸序列足够同源或者 来自所述去饱和酶氨基酸序列的氨基酸序列，该氨基酸序列包括足够显示至少一种去饱和 酶蛋白活性的氨基酸残基，所述去饱和酶氨基酸序列如在SEQ ID NO:2、4、6或8显示的氨基 酸序列。一般地说，生物活性部分包括具有至少一种去饱和酶蛋白活性的结构域或基序;下 面能力：（i)与去饱和酶底物或靶分子(如中间体脂肪酸)相互作用；和/或（ii)在去饱和酶 底物或靶分子的碳原子之间形成双键。去饱和酶蛋白的生物活性部分可以是多肽，所述多 肽例如长 10、25、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、 700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200或更多的氨基酸。
[0111] 在一个实施方案中，去饱和酶蛋白的生物活性部分包含一个血红素结合基序和/ 或至少一个组氨酸基序，最好约三个组氨酸基序。此外，可以通过重组技术制备其中缺失所 述蛋白的其它区的生物活性部分，并评价所述生物活性部分的一种或多种天然去饱和酶蛋 白功能活性。
[0112] 在一个优选实施方案中，去饱和酶蛋白具有SEQ ID N0:2、4、6或8所示的氨基酸序 列。在其它实施方案中，所述去饱和酶蛋白与SEQ ID N0:2、4、6或8基本相同，并且保持SEQ ID N0: 2、4、6或8的蛋白的功能活性，但由于天然等位基因变异或诱变而在氨基酸序列上不 同，如上文小节I详细描述。在另一实施方案中，所述去饱和酶蛋白包含与SEQ ID N0:2、4、6 或 8 至少约 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、 99 %或更多相同的氨基酸序列。
[0113] 在另一实施方案中，本发明提供由一种核酸分子编码的去饱和酶蛋白，所述核酸 分子包括与SEQ ID N0:l、3、5或7的核苷酸序列或其互补物至少约50%、55%、60%、65%、 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多相同的核苷酸序列。本发 明还提供由一种核苷酸分子编码的去饱和酶蛋白，所述核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷 酸序列在严格条件下与包含SEQ ID N0:1、3、5或7的核苷酸序列或其互补物的核酸分子的 互补物杂交。
[0114] 为确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的同一性百分比，可以为最佳比较的目的 排列所述序列（如，可以在第一个和第二个氨基酸序列或核酸序列的一个或两个中引入缺 口以获得最佳排列，并且为比较目的可以不考虑不同源的序列）。在一个优选实施方案中， 为比较目的进行排列的参考序列的长度至少是所述参考序列长度的至少30%、优选至少 40 %、更优选至少50 %、甚至更优选至少60 %、甚至更优选至少70 %、80或90 % (如，当将第 二个序列与具有519个氨基酸残基的SEQ ID N0:2的Fad4氨基酸序列进行排列时，排列至少 156个氨基酸残基、优选至少208个氨基酸残基、更优选至少260个氨基酸残基、甚至更优选 至少311个氨基酸残基、甚至更优选至少363、415或467个氨基酸残基；当将第二个序列与具 有439个氨基酸残基的SEQ ID N0:4的Fad5氨基酸序列进行排列时，排列至少132个氨基酸 残基、优选至少176个氨基酸残基、更优选至少220个氨基酸残基、甚至更优选至少263个氨 基酸残基、甚至更优选至少307、351或395个氨基酸残基；当将第二个序列与具有456个氨基 酸残基的SEQ ID N0:6的Fad5-2氨基酸序列进行排列时，排列至少137个氨基酸残基、优选 至少182个氨基酸残基、更优选至少228个氨基酸残基、甚至更优选至少273个氨基酸残基、 甚至更优选至少319、365或419个氨基酸残基；当将第二个序列与具有460个氨基酸残基的 SEQ ID NO:8的Fad6氨基酸序列进行排列时，排列至少138个氨基酸残基、优选至少184个氨 基酸残基、更优选至少230个氨基酸残基、甚至更优选至少276个氨基酸残基、甚至更优选至 少322、368或414个氨基酸残基）。然后比较在对应氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸残基 或核苷酸。当第一个序列中的一个位置与第二个序列的对应位置同一氨基酸残基占据，则 所述分子在该位置是相同的（本文所用的氨基酸或核酸"同一性"等同于氨基酸或核酸"同 源性"）。两个序列间的同一性百分比是所述序列共有的相同位置的函数，其中还要考虑为 进行所述两个序列的最佳比较而引入的缺口数量以及每个缺口的长度。
[0115] 可以使用数学算法完成两个序列间的序列比较以及确定同一性百分比。在一个优 选实施方案中，两个氨基酸序列间的同一性百分比使用Needleman和Wunsch(J.Mol .Biol. (48):444-453(1970))算法确定，其中使用犯〇881111162矩阵或?舰250矩阵，缺口加权16、14、 12、10、8、6或4以及长度加权1、2、3、4、5或6，该算法已经加入606软件包（可从11??:// www. gcg. com获得）中的GAP程序。在又一优选实施方案中，使用GCG软件包（可从http : // www. gcg. com获得）中的GAP程序确定两个核苷酸序列间的同一性百分比，其中使用 NWSgapdna. CMP矩阵和缺口加权40、50、60、70或80以及长度加权1、2、3、4、5或6。与GAP程序 一起使用的参数的优选非限制性的例子包括:Blosum 62计分矩阵，缺口罚分12,缺口延长 罚分4,移码缺口罚分5。
[0116] 在另一实施方案中，使用Meyers 和Miller 算法（Comput .Appl .Biosci. ,4:11-17 (1988))确定两个氨基酸序列或核苷酸序列间的同一性百分比，其中使用PAM120加权残基 表、缺口长度罚分12和缺口罚分4，该算法已经加入ALIGN程序(版本2.0或版本2.0U中）。
[0117] 本发明的核酸序列和蛋白序列可以进一步用作"查询序列"，对公众数据库进行搜 索以例如鉴定其它家族成员或相关序列。可以使用Altschul等（1990) J.Mol. Biol. 215: 403-10的NBLAST和XBLAST程序(版本2.0)进行所述搜索。可以使用NBLAST程序、分数=100、 字长=12进行BLAST核苷酸搜索，以获得与本发明的去饱和酶核酸分子同源的核苷酸序列。 可以使用XBLAST程序、分数=50、字长=3进行BLAST蛋白质搜索，以获得与本发明的去饱和 酶蛋白分子同源的氨基酸序列。为获得用于比较目的的带缺口的比较，可以如Altschul等 (1997)Nucleic Acids Res · 25( 17): 3389-3402所述使用缺口型BLAST。当使用BLAST和缺口 型BLAST程序时，可以使用各个程序（如XBLAST和NBLAST)的默认参数。见http:// www.ncbi.nlm.nih.govo
[0118] III.生产不饱和脂肪酸的方法
[0119] 本发明提供生产不饱和脂肪酸的新型改良方法，所述不饱和脂肪酸例如LCPUFA， 如DHA(二十二碳六烯酸，22:6(11-6))、0?4(二十二碳五烯酸，22:5(11-6))^4(花生四烯酸， 20:4(n-6))和EPA(二十碳五烯酸，20:5(n-3))。
[0120] A.用于培养细胞的重组细胞和方法
[0121]本发明还提供包括核酸序列的重组载体，所述核酸序列编码如本文所述的基因产 物，最好是Fad4、Fad5、Fad5_2和Fad6基因产物。术语重组载体包括这样的载体(如质粒）：所 述载体已经受到改变、修饰或工程化，以便其包含与天然载体或质粒中包括的那些核酸序 列相比更长、更短或不同的核酸序列。在一个实施方案中，重组载体包括有效连接调节序列 的编码至少一种脂肪酸去饱和酶的核酸序列。短语"有效连接调节序列"指目标核苷酸序列 以一定方式连接所述调节序列，所述方式允许表达所述核苷酸序列（如增强表达、增加表 达、组成型表达、基础表达、减弱表达、降低表达或抑制表达）、最好表达由所述核苷酸序列 编码的基因产物（如当将所述重组载体引入细胞时）。示例性的载体在本文中更详细地描 述，并在例如Frascotti等，美国专利第5,721，137号中有描述，该文献的内容通过引用结合 到本文中。
[0122] 术语"调节序列"包括影响（如调整或调节)其它(非调节)核酸序列表达的核酸序 列。在一个实施方案中，重组载体内调节序列相对于特定目的基因的位置和/或取向与所述 调节序列和所述目的基因的天然状态(如天然位置和/或取向）相似或相同。例如，在重组载 体中目的基因（如Fad4、Fad5、Fad5_2或Fad6基因）可以有效连接调节序列，所述调节序列在 天然生物中伴随或邻接所述基因（如有效连接"天然" ？8(14、？3(15、？3(15-2或?3(16调节序列 (如有效连接"天然"Fad4、Fad5、Fad5_2或Fad6启动子））。或者，在重组载体中目的基因（如 ?8(14、？3(15、？3(15-2或?3(16基因）可以有效连接调节序列，所述调节序列在天然生物中伴随 或邻接另一个(如不同的）基因。例如，在载体中可以包括有效连接非Fad4、Fad5、Fad5_2或 Fad6调节序列的Fad4、Fad5、Fad5_2或Fad6基因。或者，在载体中目的基因（如Fad4、Fad5、 Fad5-2或Fad6基因）可以有效连接来自另一种生物的调节序列。例如来自其它微生物的调 节序列(如其它细菌调节序列、噬菌体调节序列等)可以有效连接特定目的基因。
[0123] 优选的调节序列包括启动子、增强子、终止信号和其它表达控制元件（如转录的 mRNA中转录和/或翻译调节蛋白的结合位点）。所述调节序列在例如Sambrook, J.，Fritsh, E · F ·,和Man i a t i s , T · Mo 1 e cu 1 ar Cloning:A LaboratoryManua 1 ·第二版， ColdSpringHarborLaboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press , Cold Spring Harbor, NY, 1989中有介绍。调节序列包括那些指导细胞内核苷酸序列组成型表达的序列 (如组成型启动子和强组成型