本发明的针对CRISPR-化s9特异性敲除猪CMAH基因，成功地找到特异性祀向CMAH 基因的SgRNA,将本发明的SgRNA用于CRISPR-化s9特异性敲除猪CMAH基因的方法中，能够 快速、精确、高效、特异性地敲除猪CMAH基因，有效地解决构建CMAH基因敲除猪周期长和成 本高的技术问题。
【附图说明】
[0036] 图1为本发明实施例中使用的载体质粒lentiCRISPR v2的质粒图谱；
[0037] 图2为本发明实施例中使用的包装质粒pLPl的质粒图谱；
[003引图3为本发明实施例中使用的包装质粒pLP2的质粒图谱；
[0039] 图4为本发明实施例中使用的包装质粒pLP/VSVG的质粒图谱；
[0040] 图5为本发明实施例中酶切验证祀序列的基因敲除效果的电泳检测结果图，其中 Μ表示DNA Marker, Ctrl表示不能有效祀向CMAH基因的对照序列的祀向切割效果，2和4 分别表示表1中第2号和第4号祀序列对CMAH基因的祀向切割效果，WT表示未经过病毒 感染和化s9切割的野生型细胞的PCR产物化uiser酶切检测结果，箭头处表示经化uiser 酶切割得到的小片段；
[00川图6为本发明实施例中基于序列2的7个PIEC细胞单克隆的CMAH基因祀向切割 效果的电泳检测结果图，箭头处表示经化uiser酶切割得到的小片段，其中1、2、3、4、6、7号 细胞均有明显的切割小片段；
[0042] 图7为图6中的3和7号细胞的测序鉴定结果图，表明序列2有效地产生了 CMAH 基因突变，其中3号细胞的测序结果（图7A)，经分析包含一种缺失突变（图7C中的B1序 列），克隆还含有部分野生型基因序列（WT)，表现为图7A后半部分的双峰现象，图7A中的 箭头表示序列2介导化s9在CMAH基因上的理论切割位点；7号细胞的测序结果（图7B)， 经分析包含两种突变：一种为插入突变（在图7C中命名为D4-1)，一种为缺失突变（在图 7C中命名为D4-2)，表现为图7B后半部分的双峰现象，图7B中的箭头表示序列2介导化s9 在CMAH基因上的理论切割位点。
【具体实施方式】
[0043] 下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明。运些附图和具体 实施例不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术 人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
[0044] W下实施例中设及的试验材料和试剂：lentiCRISPR v2质粒购自Addgene公司， 包装质粒pLPl、pLP2和pLP/VSVG购自Invitrogen公司，包装细胞系肥K293T细胞购自美 国模式培养物集存库（ATCC)，PIEC细胞购自中国科学院细胞库，DMEM培养基、化ti-MEM培 养基和胎牛血清FBS购自Gibco公司，Lipofectamine2000购自Invitrogen公司。
[0045] W下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》 (第Ξ版）J.萨姆布鲁克一书中描述的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
[0046] 本发明的概括性的技术方案包括W下五个部分：
[0047] 一、Sus scrofa (猪）CMAH基因 sgRNA勒1序列的选择和设计
[0048] 1. CMAH基因的SgRNA祀序列选择：
[0049] 在CMAH基因外显子区寻找合适的20bp寡核巧酸序列作为祀序列。
[0050] 2. CMAH基因的SgRNA祀序列设计：
[0051] 将上述祀序列及互补序列分别添加接头，形成正向寡核巧酸序列和反向寡核巧酸 序列。
[0052] 二、构建CMAH基因的CRISPR载体
[0053] 1.合成上述正向寡核巧酸序列和反向寡核巧酸序列，复性形成具有粘性末端的双 链DM片段（即双链祀序列寡聚核巧酸，也可W称为双链寡聚核巧酸）。
[0054] 2.构建 CRISPR-sgRNA 表达载体：
[005引将上述双链DNA片段构建至目标载体（如lentiCRISPR v2,其质粒图谱如图1所 示），形成如lentiCRISPR V2-CMAH的慢病毒CRISPR载体。
[0056] 三获得表达CMAH sgRNA的假型慢病毒
[0057] 利用包装质粒、包装细胞系与慢病毒CRISPR载体生产表达CMAH sgRNA的CRISPR 假型慢病毒。
[005引四、感染目的细胞并检测CMAH基因敲除效果
[0059] 1.慢病毒感染目的细胞：
[0060] 将如lentiCRISPR V2-CMAH的假型慢病毒加入目的细胞培养基进行感染并进一步 培养。
[0061] 2.检测CMAH基因敲除效果：
[0062] 收集目的细胞，W基因组DNA为模板扩增包含祀序列的基因片段，经过变性、复性 及酶切，确定CMAH基因的敲除情况。
[006引五、CMAH基因敲除单克隆的挑选和鉴定
[0064] 1.对于有确定敲除效果的目的细胞群，通过稀释和单克隆培养，分离出若干单细 胞来源的细胞株。
[0065] 2.鉴定单克隆的CMAH敲除情况。
[0066] W下通过实施例详细说明本发明的技术方案及其有益效果。
[0067] 实施例一、Sus scrofa (猪）CMAH基因 SgRNA祀序列的选择和设计
[006引祀序列决定了 SgRNA的祀向特异性和诱导化s9切割目的基因的效率。因此，高效 特异的祀序列选择和设计是构建SgRNA表达载体的前提。
[0069] 1. CMAH基因的SgRNA祀序列选择
[0070] 针对CMAH基因，在祀序列选择上应该遵循下列原则：
[0071] (1)在CMAH基因外显子编码区寻找符合5' -N(20)NGG-3'规则的祀序列，其中 N (20)表示20个连续的碱基，其中每个N表示A或T或C或G，符合上述规则的祀序列位于 正义链或反义链；
[007引 似选择靠近N端的5个外显子编码区序列，祀序列可W位于CMAH基因的N端的 5个外显子编码区，或祀序列的一部分位于CMAH基因的N端的5个外显子，其余部分跨越与 相邻内含子的交界，位于相邻内含子；运样的编码区序列的切割会造成CMH基因的功能敲 除，残留截短的序列不会形成有功能的蛋白；
[007引 做如果存在多种剪切体，则在共有外显子编码区进行选择，针对CMAH基因选择 靠近N端的5个外显子编码区序列即可满足该条件；
[0074] (4)利用在线序列分析工具化ttpV/crispr. mit. edu/)分析W上祀序列在猪基 因组中的同源情况，舍弃存在显著同源序列的祀序列，根据评分进一步挑选，所挑选的祀序 列在CMAH基因上是唯一的。
[0075] 基于W上原则，选择出表1所示的祀序列集合。
[0076] 表1祀序列集合
[0077]
[0078]
[0079]
[0080] 2. CMAH基因的sgRNA祀序列设计：
[00引](1) W lentiCRISPR v2质粒作为表达载体，根据lentiCRISPR v2质粒的特点，在 上述N(20)祀序列的5'-端添加 CACCG序列，形成正向寡核巧酸序列：
[0082] 5^ -CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3^ ；
[0083] (2)在上述N (20)祀序列的反向互补序列的两端添加序列，形成反向寡核巧酸序 列：
[0084] 5^ -AAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNC-3^ ；
[0085] 正向寡核巧酸序列和反向寡核巧酸序列可W互补形成具有粘性末端的双链DM 片段：
[0086] 5^ -CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3^
[0087] -CNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA-5\
[008引实施例二、构建CMAH基因的sgRNA表达载体
[0089] 1.合成DNA插入片段
[0090] (1)合成上述设计的正向和反向寡核巧酸序列
[0091] 寡核巧酸序列可W由商业化的公司（如Invitrogen公司）根据提供的序列具体 合成。本实施例及W下实施例研究了表1中所列的第2号和第4号序列所示的祀序列对 CMH基因的敲除效果。
[0092] 第2号祀序列对应的正向寡核巧酸序列和反向寡核巧酸序列如下：
[0093] CACCGTTGAGATTGGCAGCTTCGGC(沈Q ID NO :63);
[0094] AAACGCCGAAGCTGCCAATCTCAAC(沈Q ID NO :64)。
[0095] 第4号祀序列对应的正向寡核巧酸序列和反向寡核巧酸序列如下：
[0096] CACCGTGCCGAAGCTGCCAATCTCA(SEQ ID NO ：65)；
[0097] AAACTGAGATTGGCAGCTTCGGCAC(沈Q ID NO :66)。
[0098] 将对应的正向和反向寡核巧酸序列退火、复性，形成具有粘性末端的双链DNA片 段。
[0099] 反应体系（20 μ L)如下所示：
[0100] 正向寡核巧酸（10 μ Μ) :1 μ L
[0101] 反向寡核巧酸（10 μ Μ) :1 μ L
[010引 10XPCR buffer :2 μL
[010引（1地20:16化
[0104] 将上述反应体系放入PCR仪，并按W下程序进行反应。
[0105] 反应程序：
[010引 95它，5min ;
[0107] 8(TC，5min ;
[010引 7(TC