，5min ;
[0109] 6(TC，5min;
[0110] 5(TC，5min ;
[0111] 自然降至室温。
[0112] 2.构建SgRNA表达载体
[011引 （1)利用BsmB I限制性内切酶酶切目标载体lentiCRISPR v2质粒（其序列如序 列表中SEQ ID NO :62所示）。
[0114] 按照W下反应体系进行配制：
[0115] LentiCRISPR v2 质粒：1 yg
[0116] 10 X 酶切 buffer :2 μ L
[0117] BsmB I限制性内切酶：2 μL [om] 补充d地2〇至总体积20 μ L
[0119] 将酶切反应体系置于37°C反应4h。
[0120] (2)电泳分离并纯化载体片段
[0121] 酶切结束后，将酶切混合物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，选择载体片段（约 12化）进行切割，并通过DNA凝胶回收柱进行回收。
[0122] (3)将合成的双链DNA片段与载体主片段进行连接并转化大肠杆菌
[0123] 将复性得到的双链DNA片段与回收得到的载体片段进行连接反应，按照W下反应 体系进行配制：
[0124] LentiCRISPR v2 载体片段：100ng [01巧]双链DNA片段：200ng
[0126] T4 连接酶：1μΙ
[0127] Τ4 连接反应 buffer :1 μ L
[012引 补充(1地20至总体积10 μ L
[0129] 将连接混合物置于25 °C反应化。
[0130] 反应结束后将连接混合物转化大肠杆菌D册α菌株：向连接混合物中加入100 μ L 大肠杆菌D册α感受态细胞，冰上解育30min ;将混合物放入42°C水浴，热激90s后放入冰 上冷却；向混合物加入100 μ L LB培养基，37°C摇床培养20min ;将混合物涂Amp LB平板， 37°C培养1地。
[0131] (4)鉴定正确的转化克隆
[0132] 从Amp LB平板上挑选若干菌落进行扩大培养，提取质粒进行酶切鉴定。挑选可能 正确的克隆进行测序，验证插入序列是否正确。对于正确的lentiCRISPR V2-CMAH载体克 隆进行保种。
[0133] 实施例Ξ、获得表达CMAH sgRNA的假型慢病毒
[0134] 1.材料准备
[0135] 扩增并抽提包装质粒pLPl、pLP2和pLP/VSVG(购自Invitrogen，其图谱分别如 图2、图3和图4所示）；扩增并抽提载体质粒lentiCRISPR V2-CMAH ;培养包装细胞系 肥K293T细胞（购自ATCC) ;DMEM培养基、化ti-MEM培养基和胎牛血清FBS (购自Gibco); Lipofectamine2000(购自 Invitrogen);肥K293T 细胞培养于含 5% C〇2的 37°C培养环境 中，培养基为含10 % FBS的DMEM培养基。
[0136] 2.转染和病毒包装
[0137] 第一天：将包装细胞系肥K293T传代至10cm dish,约30%融合度；
[0138] 第二天：在肥K293T达到80%融合度时按照下列配方进行转染：
[0139] 配制混合物1，包含：
[0140] lentiCRISPR V2-CMAH :6μ邑 [OW] pLPl:6yg
[014引 pLP2:6yg
[0143] pLP/VSVG:3y 邑
[0144] Opti-MEM :500 μ L。
[0145] 配制混合物2,包含：
[0146] Lipofectamine 2000:30 μ L
[0147] Opti-MEM :500 μ L。
[0148] 静置5min后，将混合物1和混合物2混匀成转染混合物，静置20min。
[0149] 将肥K293T培养基换为无血清DMEM培养基，加入转染混合物，37°C培养化后换为 20 % FBS的DMEM培养基，继续培养。
[0150] 3.病毒收集与保存
[0151] 第Ξ天：转染4化后收集含病毒的肥K293T培养基上清，用0.45 μ m滤头过滤后， 分装，放置-80°C保存。
[0152] 实施例四、感染目的细胞并检测祀序列的敲除效果
[0153] 1.材料准备
[0154] 培养目的细胞系猪髓动脉血管内皮细胞PIEC(购自中国科学院细胞库）；DMEM培 养基和胎牛血清FBS(购自Gibco);不同祀序列（序列2和序列4)的lentiCRISPR V2-CMAH 假型慢病毒；PIEC细胞培养于含5% C〇2的37°C培养环境中，培养基为含10% FBS的DMEM 培养基。
[0155] 2.慢病毒感染目的细胞
[0156] 第一天：将目的细胞传代至6孔板，约20%融合密度。每一种病毒需要一个6孔， 同时需要效率对照一个6孔。
[0157] 第二天：待目的细胞约40%融合密度时加入1血lentiCRISPR V2-CMAH假型慢病 毒上清及ImL DMEM培养基。效率对照不需要添加慢病毒。
[015引第Ξ天：感染24h后去除含病毒培养基，换成正常培养基，加入嚷岭霉素至终浓度 2 μ g/mU没有感染病毒的效率对照样品也同时加入嚷岭霉素作为对照，培养4她。
[0159] 3.细胞感染效率检测和培养
[0160] 第五天：未感染的效率对照细胞在嚷岭霉素的作用下应该全部调亡（>95% )。根 据感染慢病毒细胞的调亡情况判断细胞的感染效率，通常可W达到90% W上的感染效率 (调亡率<10% )。必要时可W将病毒上清进行浓缩或梯度稀释后进行感染W达到合适的感 染效率。
[0161] 经过嚷岭霉素筛选后，未感染的细胞发生调亡。将目的细胞重新传代并换为普通 培养基培养4她。
[0162] 4.检测CMAH基因敲除效果
[016引 （1)设计上下游引物朗Γ增CMAH基因片段，其中上下游引物序列如下所示：
[0164] AACGACAGACTATGAGCAGGCAAG(SEQ ID NO ：67)
[01 巧]CTTCCATTTAGATCCTCAATGTCTTTAATGAAG(SEQ ID NO :68)。
[0166] 目的扩增片段包含sgRNA祀序列，大小为46化P。祀序列至片段两端的位置不少于 lOObpo
[0167] (2)收集部分目的细胞，使用promega基因组DNA试剂盒抽提基因组DNA。同时抽 提野生型目的细胞的基因组DM。
[0168] (3) W基因组DM为模板扩增包含祀序列的CMAH基因片段（包括感染的突变样品 和野生型样品）。
[0169] 扩增反应体系（20 μ L)如下：
[0170] 上游引物（10 μΜ) :1 μ L
[0171] 下游引物（10 μ Μ) :1 μ L
[017引 2XPCR Mix :10 μL
[017引 基因组 DNA:100ng
[0174] W上述反应体系进行配制，放入PCR仪，并按下列程序进行反应。
[0175] 反应程序：
[0176] 95 °C , 3min
[0177] 95°C , 30s
[017 引 58°C，20s
[0179] 72°C , 20s
[0180] 72 °C , 3min ；
[0181] 其中第二步至第四步重复35个循环。
[0182] (4)电泳检测PCR产物并回收纯化
[018引 （5)将纯化后的DNA片段分别加热变性、复性，形成杂交DNA分子（包括突变样品 和野生型样品）。
[0184] 反应体系如下所示：
[0185] 基因组PCR片段：200ng
[0186] 5X 反应 buffer :2 μ L
[0187] 反应体系共9 μL
[0188] W上述反应体系进行配制，放入PCR仪，并按下列程序进行反应。
[0189] 反应程序：
[0190] 95 °C , 5min ；
[0191] 80 °C , 5min ；
[019引 7(TC，5min;
[019引 60°C , 5min ;
[0194] 50 °C , 5min ；
[0195] 自然降至室溫。
[0196] (6)用化uiser酶切割复性后的杂交DNA(包括突变样品和野生型样品）
[0197] 向经过变性、复性的反应混合物加入1 μ L化uiser酶，45°C解育20min。
[019引 （7)电泳检测酶切产物，检测祀序列介导的CMAH基因敲除效果。
[0199] 将经过酶切的DNA片段用2%的琼脂糖凝胶进行电泳分析，100V，25min。确定目的 片段的切割情况，判断祀序列的基因敲除效果。
[0200] 对突变DNA的切割识别基于W下原理：经过感染的细胞会表达sgRNA和化s9。基 因组DNA如果被sgRNA介导的化s9蛋白祀向切割，经过修复后会在切割位点附近引入突变 (野生型变为突变型）。由于野生型和突变型序列在该位置不匹配，W此为模板扩增出的野 生型DM与突变型DM经过变复性形成的杂交分子会就产生局部的环形（loop)结构。而 后者可W被化uiser酶识别并切断，导致杂交DNA分子被切割成小片段。
[020。 结果如图5所示，对照序列（序列表中的SEQ ID NO :69)不能有效祀向CMAH基因 产生切割，因此未检测到小片段；未经过病毒感染的野生型细胞的PCR产物也未检测到小 片段；