烟草中在XylTl(沈Q ID N0:33至43)和XylT2(SEQ ID NO: 44至54)基因处由XylT_T04 mRNA诱导的突变的示例的序列比对。
[0039] 发明详述
[0040] 本文提供了编辑植物基因组W生成非转基因植物材料的新策略。使用设计为识别 植物基因组的任意位点中的特异性序列的核酸酶来进行本发明的方法。
[0041] 在一个方面中，本文设及对植物基因组的祀向遗传修饰而不插入外源性遗传物质 的方法，该方法包括W下步骤中的一个或多个：
[0042] i)提供植物细胞，其包含待修饰的内源性基因；
[0043] ii)获得包含序列识别结构域和核酸酶结构域的序列特异性核酸酶；
[0044] i i i)用所述序列特异性核酸酶转化植物细胞，并且
[0045] iv)在基因组中诱导一个或多个双链DNA断裂；
[0046] 该方法旨在产生一种或多种具有可检测祀向基因组修饰的植物细胞，优选植物基 因组中不存在任意外源性遗传物质。
[0047] 基因组中诱导双链断裂一般导致由非同源末端连接(NHEJ)修复断裂，其有利于在 通过该方法获得的植物细胞的基因组中删除、校正或插入遗传序列。
[0048] 在核酸酶的编码序列已经合成并克隆到表达载体之后，产生并纯化核酸酶蛋白质 或mRNA。为了改善功效，可加入细胞穿透肤(CPP)来改善对小分子(药物）、蛋白质和核酸的 细胞膜穿透性(M敵和Langel，2006;US 2012/013502UUS 2011/0177557、US 7,262,267)。 也可加入亚细胞定位肤来引导细胞内的蛋白质运输，尤其是运向核（Gai等，2012 ;US 20050042603)。
[0049] 在一些实施方式中，具有外切核酸酶活性的蛋白质，例如，Trex(W0 2012/058458) 和/或Tdt(末端脱氧核巧酸转移酶）(WO 2012/13717)共同递送到植物细胞中W增加序列特 异性核酸酶诱导的诱变效率。Trex2(SEQ ID N0:6)已经显示通过如本文所述增加诱变而特 别有效。使用表达成单多肤链的化ex2(SEQ ID N0:7)甚至是更有效的。
[0050] 通过多种方式向植物细胞递送纯化的核酸酶。例如，可使用生物弹射颗粒递送系 统来转化植物组织。标准PEG和/或电穿孔方法可用于原生质体转化。转化后，培养植物组 织/细胞W能够进行细胞分裂、分化和再生。可分离来自单独事件的DNA并筛选突变。
[0051 ]在一些实施方式中，序列特异性核酸酶是TA^效应子核酸酶（Beurdeley等， 2013)。也考虑了可使用任意类型的序列特异性核酸酶来进行本文所述的方法，前提是其具 有与TAk效应子核酸酶类似的能力。因此，其必须能够在一个或多个祀向的遗传基因座处 诱导双链DNA断裂，在基因座处产生一个或多个祀向突变，其中通过NHEJ或其它机制错误地 修复断裂来产生突变(Certo等，2012)。运类序列特异性核酸酶包括，但不限于ZFN、寻祀内 切核酸酶如I-Scel和I-Crel、限制性内切核酸酶和其它寻祀内切核酸酶或TALEN?。在具体 实施方式中，待使用的内切核酸酶包括CRISPR-相关的Cas蛋白，如Cas9(Gasiunas等， 2012)。
[0052] 待递送的序列特异性核酸酶可W是纯化的核酸酶蛋白的形式或可在转染后翻译 成蛋白质的mRNA分子形式。可通过多种本领域技术人员已知的手段制备核酸酶蛋白质，使 用可购得的蛋白质表达载体，诸如但不限于P犯或祀T。合适的载体允许核酸酶蛋白质在多 种细胞类型(大肠杆菌、昆虫、哺乳动物）中的表达和后续纯化。也可通过多种本领域技术人 员已知的手段合成mRNA形式的核酸酶，如通过使用T7载体(PSF-T7)，其允许产生用于转染 到细胞中的加帽的RNA。
[0053] 在一些实施方式中，用最佳的5'非翻译区（UTR)和3'非翻译区修饰hiRNAdUTR已被 证明通过对定位、稳定性和翻译效率的调节在基因表达的翻译后调节中起到关键作用 (Bashirul lah，2001)。如上所述，由于其非转基因性质需要mRNA递送;然而，mRNA是非常易 碎的分子，其易于在植物转化过程中降解。在植物mRNA转化中使用UTR使得mRNA分子增加稳 定性和定位，获得对非转基因基因组修饰而言增加的转化效率。
[0054] 在一些实施方式中，工程改造的核酸酶包括一个或多个亚细胞定位结构域，W允 许核酸酶蛋白质在细胞内尤其是向核中高效运输(Gai等，2012;US 2005/0042603)。运种定 位信号可包括，但不限于SV40核定位信号化icks等，1993)。其它非经典核定位信号类型也 可适用本文提供的方法，如hnRNP A1的酸性M9结构域或PY-NLS基序信号（D0rmann等， 2012)。也可包含定位信号W允许核酸酶运输到其它亚细胞小室中，如线粒体或叶绿体。可 在多种出版物(参见化ushan S.等，2006)中找到使用特定线粒体和叶绿体信号的指南并且 修饰蛋白质如核酸酶W包括运些信号的技术是本领域技术人员已知的。
[0055] 在一些实施方式中，核酸酶包括细胞穿透肤区域(CPP)W允许更容易地递送蛋白 质通过细胞膜（M龄和Langel，2006;US 2012/0135021，US 2011/0177557，US 7,262,267)。 运类CPP区域包括但不限于反式激活转录激活（Tat)细胞穿透肤化akshmanan等，2013， 化ankel等，1988)。也可考虑使用其它CPP，包括化p-lCPP区域，其特别适用于辅助蛋白质向 植物细胞递送(参见，化U曲等，2009)。
[0化6] 在一些实施方式中，在乙酷乳酸合酶(ALS)基因 ALS1或ALS2之一的编码序列中生 成一个或多个突变，或者在液泡转化酶(VInv)基因中生成一个或多个突变。在运些实施方 式的另一个方面中，突变可W是任意的转换或翻转，其在预定基因座处产生非功能性或功 能性降低的编码序列。一般可考虑使用本文所述的方法在任意特定基因组基因座处生成一 个或多个突变。
[0057]在一些实施方式中，本文提供的方法中使用的植物物种是本赛姆氏烟草 (N.ben化amiana)，虽然在其它方面中，植物物种可W是任意单子叶或双子叶植物，诸如(但 不限于）拟南芥(Arabidopsis thaliana);农作物（例如，首猜、大麦、豆类、玉米、棉花、亚 麻、魏豆、油菜、水稻、黑麦、红花、高梁、大豆、向日葵、烟草和小麦）；蔬菜作物(例如，芦算、 甜菜、花挪菜、甘蓝、胡萝l·、菜花、芹菜、黄瓜、茄子、窝宦、洋葱、辣椒、马铃馨、南瓜、萝l·、渡 菜、算瓜、芋、番茄和西葫芦）；水果和坚果作物（例如，杏仁、苹果、杏、香蕉、黑替、蓝替、可 可、樓桃、挪子、蔓越替、海要、faioa、棲子、葡萄、葡萄抽、番石恼、雜猴桃、巧樣、酸澄、芒果、 瓜、油桃、澄、木瓜、西番莲果、桃、梨、渡萝、开屯、果、李、覆盆子、草替、红橘、胡桃、和西瓜）； 和观赏植物(例如，赤杨、灰树、白杨、杜酷花、枠木、黄杨木、山茶、康乃馨、菊花、愉树、杉树、 常春藤、莱莉、杜松、栋树、栋桐、杨树、松树、红木、杜酷花、玫瑰和橡胶树)。
[0058] 在一些实施方式中，通过PEG-介导的分离的原生质的转化向植物细胞中递送蛋白 质或编码核酸酶构建体的mRNA。一般W-半至等体积的待转染的mRNA或蛋白质悬浮液的范 围使用PEG，该目的中最常用PEG40 %。
[0059] 在一些情况中，通过生物射弹转化方法或通过本领域已知的任意其它合适的转染 方法来递送核酸酶(Yoo等，2007)。在生物射弹转化的情况中，可用生物射弹装置将核酸酶 导入植物组织中，其加速微颗粒至300-600m/s的速度，其足W穿透植物细胞壁和细胞膜(参 见，Klein等，1992)。另一种向植物导入蛋白质或RNA的方法是通过对祀细胞超声。
[0060] 替代地，可使用脂质体或原生质球融合来向植物中导入外源物质（参见，例如， 化ristou等，1987)。对原生质体W及完整的细胞和组织进行电穿孔也已见诸报道化aursen 等，1994)。
[0061] 根据用于转染的方法及其效率，发明人确定用于进行本文所述方法的最优蛋白浓 度，尤其是TALEN?，是0.01至0.化g/μL，当使用阳G时，蛋白质悬浮液的体积一般为2至20μ1。 发现RNA浓度在1至化g/μL的范围内最优，认为其有时优选加入多至lOygAil的非编码RNA， 如tRNA载体，W增加 RNA的量。运种之后的RNA添加改善了转染并且针对植物细胞中包含的 降解酶对编码核酸酶的RNA有保护作用。
[0062] 可通过再生由本文所述的任意方法产生的植物细胞来获得植物。当内源性基因的 功能在祀DNA位点处导入非沉默突变的植物细胞中得到抑制时，从运种植物细胞再生的植 物的表型可与抑制该内源性基因的功能相关变化。因此，本文所述的方法能够高效进行植 物育种。可通过本领域技术人员已知的方法从植物细胞再生植物，运取决于植物细胞的种 类。因此，示例包括化ristou等（1997)所述的用于转化水稻物种的方法。
[0063] 在一些实施方式中，核酸酶可与编码一个或多个外切核酸酶蛋白质的质粒共递送 W增加序列特异性核酸酶的诱变效率。运类外切核酸酶包括，但不限于外切核酸酶的化ex 家族成员（治疗性红细胞交换外切核酸酶），如TREX2(Shevelev等，2002)。发明人已经惊讶 地发现，与单独递送I-Scel蛋白质相比，外切核酸酶如TREX和纯化的I-Scel蛋白质的共递 送增加了观察到的NHEJ事件的频率。注意到其它合适的外切核酸酶也可用于本文所述的方 法。
[0064] 本文所用术语"相同性"是指两个核酸分子或多肤之间的序列相同性。通过比较各 序列中的位置来确定相同性，所述序列可进行比对用于比较目的。当比较序列中的位置被 相同碱基占据时，则该分子被认为在该位置上是相同的。核酸或氨基酸序列之间的相似或 相同性程度随着核酸序列共有位置的相同或匹配核巧酸数量而变化。使用比对算法和程序 来计算两条序列之间的相同性。FASTA和BLASTWGCG序列分析包(威斯康辛州麦迪逊的威斯 康辛大学（University of Wisconsin,Madison，WI))的一部分购得，并且W默认设置使用。 BLASTP也可用于采用相似性矩阵如化0SUM45、化0SUM62或化0SUM80鉴定与参比氨基酸序列 有至少80%、85%、87.5%、90%、92.5%、95%、97.5%、98%或99%序列相似性的氨基酸序 列。除非另外说明，相似性评分基于使用化0SUM62。当使用化ASTP时，相似性百分比基于 BLASTP相似性评分并且序列相同性百分比基于BLASTP相同性评分。BLASTP"相同性"显示高 评分序列对中相同的总残基的数量和分数;并且BLASTP"相似性"显示比对评分具有相似值 和互相相似的残基的数量和分数。本文考虑并包括具有与本文所述的氨基酸序列的运些相 同度或相似度或任意中间的相同度或相似度的氨基酸序列。运适用于适用BLASTN的多核巧 酸序列。
[0065] 本文所用术语"同源性"往往表示与另一条序列有足够相同性W产生序列之间的 同源重组的序列，更具体地具有至少95 %相同性(例如，至少97 %相同性，或至少99 %相同 性)。
[0066] 本文所用术语"内切核酸酶"是指能够在高度特异性位置上产生DNA分