0098] 实施例8:编码序列特异性核酸酶的mRNA的制备。
[0099] 包含大范围核酸酶、锋指核酸酶(ZFN)或转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN?) 的序列特异性核酸酶克隆到T7表达载体中（图9)。基于来自对拟南芥的转录本衰变速率的 全基因组研究的数据选择几种不同的5'和3'UTR对(化rsai ,2007)。所选择的序列是基于多 种不同的转录本的半衰期和功能分类。合成运些UTR对W允许方便地克隆到T7-驱动的质粒 载体中。通过SapI消化使所得的核酸酶构建体线性化;SapI位点刚好位于聚A序列之后。线 性化的质粒用作使用T7叫化曰试剂盒（生命技术公司(；Life Technologies Corporation)) 体外产生mRNA的DNA模板。替代地，可通过商业供应商制备编码核酸酶的mRNA。合成的mRNA 溶于无核酸酶的蒸馈水中并储存在-80°C下。
[0100] 实施例9: WmRNA递送的序列特异性核酸酶对附加体祀标的活性。
[0101] 使用单链退火(SSA)试验来测量已经转化到烟草原生质体中的核酸酶mRNA的活性 (Zhang等，2013)。如实施例4所述，SSA试验使用由核酸酶切割的非功能性YFP报告子。切割 后，报告子中的重复序列之间的重组重建功能性YFP基因。然后可通过流式细胞术对YFP巧 光进行定量。
[0102] 为了确定mRNA是否可递送到植物细胞中并介导祀向DNA修饰，I-Crel mRNA与SSA 革己标质粒一起通过PEG-介导的转化导入烟草原生质体中（GoIds等，1993，Υοο等，2007， Zhang等，2013) dSSA报告子具有在YFP的重复序列之间的I-化el位点。之前描述了烟草原生 质体制备和转化的方法(Zhang等，2013)。单独的SSA祀标质粒用作阴性对照。作为阳性对 照，用表达I-Crel (p35S-I-CreI)和I-Crel SSA报告子的DNA构建体转化细胞。转化后24小 时通过流式细胞术测量YFP巧光（图10) dp35S-I-化el DNA和I-化el mRNA都观察到SSA报告 子的相似水平的祀向切割。数据证明可成功地将mRNA形式的功能性核酸酶递送到原生质体 中。
[0103] 实施例10: WmRNA递送的序列特异性核酸酶对染色体祀标的切割活性。
[0104] TALEN对(XylT TALEN?)设计为切割本赛姆氏烟草的内源性β1，2-木糖基转移酶基 因（Strasser等，2008)(图11)。运些基因称为Xy口1和Xy口2，并且TALEN?识别在两种基因中 发现的相同序列。各XylT TALEN?被亚克隆到T7-衍生的表达质粒中（图12)。如实施例8所 述，所得的TALEN?表达质粒通过SapI消化线性化并用作体外产生mRNA的DNA模板。
[0105] 接着通过阳G-介导的转化将TALEN?-编码质粒DNA或mRNA导入本赛姆氏烟草原生 质体(Golds等，1993,化0等，2007，Zhang等，2013)。从1月龄的本赛姆氏烟草的充分展开的 叶中分离原生质体。将原生质体密度调节至5x lOVml至IxloVml的细胞密度，并且每次转 化使用20化1的原生质体。对于mRNA递送，通过混合15μ 1的kTALEN mRNA (化g/μ 1)、15μ 1的 R-TALEN mRNA(2ygAU)和10μ1的酵母tRNA运载体（lOygAU)来制备RNA混合物。为了最小化 RNA酶的潜在降解，向20化1的原生质体中快速加入RNA混合物，并且通过手指敲击溫和混合 几秒。几乎立即加入21化1的40%PEG，并且通过手指敲击充分混合1分钟。转化反应在室溫 下解育持续30分钟。加入90化1洗涂缓冲剂来停止转化。在两次洗涂之后，转化的原生质体 在SxloVml的细胞密度下在K3/G1介质中培养。也转化编码TALEN的质粒DNA作为阳性对照。
[0106] 处理后3天收获转化的原生质体并制备基因组DNA。使用从原生质体制备的基因组 DNA作为模板，通过PCR扩增包含TALEN?识别位点的约300-bp片段。随后对PCR产物进行454 焦憐酸测序。认为间隔子区域中具有插入/缺失（indel)突变的测序读数来源于通过非同源 末端连接(NHEJ)对经切割的TALEN?识别位点的不精确修复。诱变频率的计算公式为具有 NHEJ突变的测序读数数目除W总测序读数。
[0107] Xyl_T04 TALEN? DNA和mRNA针对其祀标测试，即本赛姆氏烟草中的XylTl和Xy口2 基因。如上所述，TALEN?识别位点同时存在于XylTl和XylT2基因。如图12所总结的那样， Xyl_T04TALEN?质粒DNA在两种基因中诱导非常高频率的NHEJ突变，范围为31.2%至 54.9%。同样，乂71_1'04了41^护《1111?酷也在两种基因中诱导高频率畑61突变，范围为22.9% 至44.2%。XylTl和XylT2基因座上TALEN?-诱导的突变的示例示于图13。
[0108] 其他实施方式
[0109] 应理解虽然本发明已结合其详述进行描述，但W上描述意在说明而不是限制本发 明的范围，该范围由所附权利要求的范围限定。其他方面、优点和修改在W下权利要求的范 围内。
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