梅毒螺旋体抗 体。检测时，样品中所有的梅毒螺旋体抗体先和胶体金间接标记的标记抗原结合，由于毛细 管作用，反应复合物沿包被膜向前泳动，若样品中有梅毒螺旋体抗体，到达检测线160时，遇 到包被在硝酸纤维素膜140上的包被抗原，就会形成包被抗原_待测梅毒螺旋体抗体-标记 抗原-标记物复合物，从而富集在检测线160上，形成红色沉淀线;未结合梅毒螺旋体抗体的 金标记梅毒抗原则通过检测线160,被羊抗鼠单抗捕获，富集在质控线170上，形成红色沉淀 线。当检测线160与质控线170上同时有红色沉淀线时判为阳性结果。若样品中不含有梅毒 螺旋体抗体，反应复合物到达检测线160时，遇到包被抗原就不会形成包被抗原-待测梅毒 螺旋体抗体-标记抗原-标记物复合物，反应复合物通过检测线160,仅富集在质控线170上 形成红色沉淀线，此时判为阴性结果。
[0083]下面为具体实施例部分。
[0084] 以下实施例中，如无特别说明，未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件， 例如参见萨姆布鲁克、EF弗里奇、T曼尼阿蒂斯等(金冬雁，黎孟楓等译)所著的的分子克隆 实验指南[M](北京:科学出版社，1992)中所述的条件或者试剂盒生产厂家推荐的方法实 现。所有操作均采用本领域标准操作过程，所采用的试剂或载体等均为常规试剂或常规载 体。
[0085] 实施例1
[0086] 包被、标记抗原、免疫源和杂交瘤细胞筛选抗原的制备。
[0087] 通过文献查阅及生物信息学分析梅毒螺旋体TpN17(GeneBank No:M74825)、TpN15 (GeneBank No :U73115 · I)、TpN47(GeneBank No :NC_000919 · I)基因优势表位，设计重叠 PCR 引物人工合成 TpN17(23aa-106aa)、TpN15(31aa-109aa)、TpN47(185aa-410aa)所对应活性 区段，通过桥式PCR扩增并引入有助于可溶性表达的柔性链接肽TRX，获得嵌合基因，将该基 因和PMD18-T载体连接，转化大肠杆菌，挑取单克隆，PCR鉴定正确的阳性质粒，提取质粒酶 切鉴定。将PCR鉴定和酶切鉴定都正确的质粒送测序，结果和设计序列完全一致。将测序正 确的质粒用设计在其两端的酶切位点相应的酶进行酶切，切出的目的序列连入表达载体 pET-24a中。包被抗原的重组质粒为pET-24a-TPAG-TRX(含HIS tag)，该质粒为双顺反子表 达的质粒，其中TRX为第二顺反子;标记抗原的重组质粒为PET30a-GST-TPAG-TRX(含HIS tag及GST peptide)，该质粒为双顺反子表达的质粒，其中TRX为第二顺反子。
[0088] TPAG为TPN15-TPN17-TPN47嵌合表达抗原的表达序列，序列如SEQ ID No.l所示； TRX为嵌合表达多肽的表达序列，序列如SEQ ID No. 2所示。
[0089] 免疫源和杂交瘤细胞筛选抗原使用PGEX-2T、PGEX-6P-1、PGEX-5X-1、pET-41a质粒 转化表达宿主菌ER2566。
[0090]取适量转化后宿主菌涂布于带抗性的LB固体培养平板上，37°C，培养过夜，第二天 挑取7株在抗性培养平板上能生长的菌落，接种于3mL带抗性的LB液体培养基中，37°C培养 5h，同时取转化有空载体的宿主菌做对照。加入终浓度为0.25mM的IPTG，30°C，180rpm诱导 培养6h。离心收集菌体，用40yL 20mM PBS缓冲液重悬菌体，加入20yL 3XloadingBuffer， 沸水煮10分钟后，SDS-PAGE电泳。考马斯亮兰染色，转化进重组质粒的菌株在预测的分子量 位置有一条明显的蛋白表达带，而只转化进空质粒的菌株没有该条带。。
[0091]将1微升的转化宿主菌接种于500mL加有抗性的LB培养基中，37°C，200rpm培养过 夜，第二天早上加入IPTG至终浓度为0.25mM，30°C，180rpm诱导4h。离心收集菌体，加入适量 裂解缓冲液，超声破碎后离心取上清。分别进行硫酸铵梯度分析，经分析包被抗原用10%饱 和硫酸铵进行沉杂蛋白，用20%硫酸铵沉目的蛋白；标记抗原用35%直接沉淀目的蛋白；免 疫源和杂交瘤细胞筛选抗原用15%饱和硫酸铵进行沉杂蛋白，用30%硫酸铵沉目的蛋白。 经硫酸铵处理后得到粗抗原。包被抗原经NI亲和介质纯化和SP离子交换层析获得目的蛋白 并保证平衡液和洗脱缓冲液中含有0.15%吐温20或Triton X-100;标记抗原经NI亲和介质 纯化和谷胱甘肽亲和介质纯化获得目的蛋白；两种抗原最终纯度均达到90%以上(见图5， 包被抗原和标记抗原SDS-PAGE胶纯度电泳图：泳道1蛋白Marker;泳道2纯化后包被抗原;泳 道3纯化后标记抗原），-20°C保存备用。免疫源和杂交瘤细胞筛选抗原经谷胱甘肽亲和介质 纯化获得目的蛋白，_20°C保存备用。
[0092] 实施例2
[0093]抗GST单克隆抗体的制备。
[0094] 将以上获得的重组GST蛋白溶液用PBS透析之后，用PBS稀释到1.0mg/mL，与弗氏完 全佐剂等体积混合，并充分乳化，得到油状乳液。将该乳液以〇.2mL的剂量皮下施给6周龄雌 性BALB/c小鼠背部位点。第一次免疫14天后腹腔增强免疫，即等量抗原与弗氏不完全佐剂 等体积混合，增强免疫到四针后，采尾血，分离血清，用间接ELISA法测定效价，效价高于1: 10000即可用于融合。融合前3天，用相同剂量抗原与等体积0.9%氯化钠注射液混合腹腔注 射追加免疫，免疫方法同上。
[0095]以BALB/c鼠腹腔巨噬细胞作饲养细胞。在融合前1天，BALB/c鼠拉颈处死，75 %酒 精全身浸泡，超净台内，无菌操作下用剪刀剪开腹部皮肤，暴露腹膜，用注射器腹腔注入 RPMI 1640基础培养液5mL，反复冲洗，回收冲洗液，1000 rpm，离心5分钟，留沉淀，用RPMI 1640筛选培养液(含HAT的RPMI 1640完全培养液中）重悬，调整细胞浓度I X IO5个/mL，加入 96孔板，150yL/孔，37°C，5 % C02培养过夜。
[0096] 小鼠末次免疫后三天，在无菌条件下取出脾脏，置于平皿中，RPMI 1640基础培养 液冲洗一次，放于小烧杯的尼龙网上磨碎过滤，制成细胞悬液。离心，弃上清，RPMI 1640基 础培养液重悬，如此重复三次，计数。
[0097]小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0经8-氮鸟嘌呤筛选后，培养至对数生长期，取两大瓶制成细 胞悬液，离心，弃上清，用RPMI 1640基础培养液重悬，如些重复三次，计数。
[0098] 将骨髓瘤细胞与免疫脾细胞按1:10比例混合，在50mL塑胶离心管内用RPMI 1640 基础培养液洗1次，I，200rpm，离心8分钟。弃上清，将细胞混匀，缓慢加入ImL 50 %的 PEG1500融合，融合1分钟后加入15mL的RPMI 1640基础培养液终止细胞融合。l，000rpm，离 心5分钟。弃上清，用50mL的RPMI 1640筛选培养液轻轻混悬，平分于10块96孔板（已铺饲养 细胞），50yL/孔，37°C，5 % C02培养。培养至第六天，换HT培养液(含HT的RPMI 1640完全培养 液)两次。
[0099] 用0 · 06M pH9 · 6碳酸缓冲溶液稀释不同的GST重组蛋白（分别是:PGEX-2T、PGEX-6P-1、PGEX-5X-1、pET-41 a、PET30a-GST-TPAG-TRX)，同时pET-24a-TPAG作为阴性对照，使其 终浓度为以8/111匕每孔0.11^加入96孔聚苯乙烯板，37°02小时或4°(3过夜。次日，用含10%小 牛血清或1 %脱脂奶粉的0.02M pH7.2PBS，0.15mL/孔，37°C封闭2小时，用于检测。重组融合 后第七天，取细胞上清0.1 mL于上述96孔检测板中，37°C30分钟，水洗六次后加入2000倍稀 释的辣根过氧化酶标记的羊抗鼠 IgG，37°C30分钟同上洗后，加 TMB显色剂显色15分钟，加入 稀硫酸溶液，每孔50yL，测450nm吸收值。PRMI 1640完全培养液作为阴性对照，以测定值与 对照值得比^2.0为阳性细胞孔。共检测有杂交瘤细胞的378孔，其中同时对上述五个含GST 的蛋白有反应的阳性孔为77个。经过三次有限稀释克隆，最后获得12株稳定分泌抗GST蛋白 的细胞株。
[0100] 选6-8周健壮的BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射0.5mL的降植烷；10天后腹腔注射1 X IO6个杂交瘤细胞。接种细胞7~10天后可产生腹水，密切观察动物的健康状况与腹水征 象，待腹水尽可能多，而小鼠频于死亡之前，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中，一般一只 小鼠可获5~IOmL腹水。收集腹水，离心取上清，放于-20°C冰箱保存。
[0101]取腹水上清，用3倍体积的PBS稀释后滤纸过滤。将所得的滤液在lmL/min的流速下 加到一个已用PBS平衡的蛋白G亲和层析柱。然后用PBS以lmL/min的流速洗涤未被蛋白G吸 附的物质直至在0D280nm下的吸附值达到基线为止。再用0.2M的甘氨酸洗脱液(pH2.5)洗脱 并回收该抗体。所回收的溶液用〇. IM TRIS(pH8.8)中和，通过超滤将抗体浓度调节到一个 合适的浓度，_20°C冻存。
[0102] 实施例3
[0103] GST单克隆抗体的胶体金标记工艺、TP间接标记检测系统的摸索。
[0104] 取ImL胶体金放小玻璃杯中，搅拌加入10yL、15yL、20yL的0.2M