为探针，Aml3(GenBank access1n n0.EF094988)引物为fwd (5 ’ -CAAATCAGGCATGCAAATAA-3 ’)和rev (5 ’ -TGTATGCTCTTACTGCTTTGGA-3 ’)以蒙古沙冬青为模板扩增重复序列。分别标记FITC绿色和Texas Red红色荧光；
S3:探针与染色体共变性，制备好的染色体玻片，经过120-125毫焦/平方厘米的紫外交联仪处理I分钟固定染色体，在染色体位置加5微升的探针，其质量不超过100纳克，盖上盖玻片，放入密闭保湿的饭盒中，在沸水中煮沸15分钟，迅速冷却变性的染色体和探针；
S4:杂交与杂交后洗脱，遮光变性的玻片和探针，取出玻片放入55°C烘箱中，经过大于4小时的保温复性杂交，取出玻片置于含2 X SSC溶液的玻片染色缸中，室温漂洗5分钟，去除玻片，接着转至另一含2 X SSC溶液的玻片染色缸，55°C漂洗25分钟，取出玻片，空气晾干后保湿；
S5:制片与信号检测，在制备好的玻片上滴加荧光染料5微升DAPI(4’，6-二脒基-2-苯基吲哚)和5微升2 X SSC溶液，盖上盖玻片，在盖玻片上覆上吸水纸，用橡皮敲打1-2分钟，使用德国DM750M徕卡金相显微镜观察，找到良好的染色体分裂相，用不同的激发光获得，蓝色，红色和绿色的杂交信号；用Lecia CW4000 FISH software进行图像采集与合成。
[0019]所述步骤S2中的Nick translat1n法制备探针，成分为:DNA (200纳克/毫升)，10.0微升；1x Nick translat1n缓冲液，2.0微升；荧光标记的dNTP(lmM)，0.5微升;无荧光标记的dNTPs(2 mM)，2.0微升;DNA聚合酶I (10U/微升)，8.0微升;DNase (100 mU/微升)，0.4微升;总体积22.9微升;制备方法为:混合物混匀后放入PCR仪15° C保温2小时;加入175微升的含140纳克/微升鲑鱼精DNA的5 X TAE pH 5.2终止反应，并混匀，加入500微升大于2小时沉淀探针后16000rpm;离心30分钟，70%乙醇洗涤2遍，加入100微升的2 X SSC溶解探针，使探针终浓度为20纳克/微升，_20°C避光储存备用。
[0020]在本实施例中，所述蒙古沙冬青的核型模式为2n = 2x =18= 2sm(SAT)+ 6 m + 8sm + 2st0
[0021]本发明所用试剂:
20 X SCC溶液(柠檬酸钠缓冲液):在800毫升水中溶解175.3克NaCl和88.2克柠檬酸钠，加入数滴10摩尔/升NaOH溶液调节pH值至7.0，加水定容至I升，分装后高压灭菌；
2X SCC溶液:水与20 X SCC溶液体积比为9:1的溶液；
140纳克/微升鲑鱼精:将140毫克鲑鱼精粉末溶于I升蒸馏水，沸水溶解5分钟后-20°C保存。
[0022]如图1所示，本发明在现有技术基础上，用N2O处理根尖，采用90%冰醋酸固定1min后转入70%乙醇保存，酶解后，用冰浴蒸馏水与无水乙醇两次洗涤后，加冰醋酸展片，使蒙古沙冬青中期染色体凝聚较好，根尖细胞解离充分，染色体分散均匀、容易计数;本发明的探针制备放在15°CPCR仪保温2 h，时间温度精确控制，然后沉淀纯化探针。并采用紫外交联仪固定玻片染色体，减少染色体被洗脱风险;且用沸水浴煮沸探针与染色体一起变性，方法简单，无污染;还通过采用2XSSC室温洗脱和2XSSC 55°C洗脱相结合的方法，步骤简便，无污染。本发明清楚地显示了蒙古沙冬青的染色体，荧光信号强，杂交特异性高，确定了适合蒙古沙冬青的FISH方法。
[0023]如图2、图3、图4、图5、图6所示，本发明通过观察18SrDNA、5SrDNA、Aml3和端粒(Telomere)的探针在蒙古沙冬青染色体上的分布，辨析同源染色体与非同源染色体，有助于核型分析，对于蒙古沙冬青染色体物理图谱构建，引种栽培和资源的保护利用具有重要的理论和实践意义。
[0024]如图7所示，图中显示蒙古沙冬青的5S rDNA和18S rDNA基因都分布于第一对染色体上;5S rDNA在蒙古沙冬青分布在次缢痕(图7c)。
[0025]以上对本发明所提供的一种蒙古沙冬青染色体荧光原位杂交的方法进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在【具体实施方式】及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
[0026]最后应说明的是:以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种蒙古沙冬青染色体荧光原位杂交的方法，其特征在于，包括以下步骤: SI:染色体玻片标本的制备，蒙古沙冬青种子在28°C温箱中常规培养，待根尖生长至2-3厘米时，切下生长旺盛的根尖在1.5毫升离心管中保持湿润，置密闭容器中用N2O处理2.5小时，取出根尖用90%冰醋酸处理10分钟，即转入70%乙醇中固定，置_20°C长期备用，取固定后的2-3个根尖，用蒸馏水洗净，切生长点放入含1%果胶酶和2%纤维素酶的缓冲液中，37°C解离45分钟，离心先后用冷蒸馏水，无水乙醇洗涤两遍，最后放入30微升冰醋酸中，每张玻片滴5微升左右悬液展片，空气干燥后放紫外交联仪处理固定染色体，镜检分散良好的染色体玻片，置_20°C长期备用； S2:18SrDNA、5SrDNA和端粒探针制备与探针变性，选取同属于豆科的植物大豆5SrDNA和18SrDNA序列设计引物，以蒙古沙冬青为模板扩增重复序列，采用Nick translat1n法制备探针，端粒采用拟南芥端粒DNA序列为探针，Aml3引物为fwd和Aml3以蒙古沙冬青为模板扩增重复序列。2.分别标记FITC绿色和TexasRed红色荧光； S3:探针与染色体共变性，制备好的染色体玻片，经过120-125毫焦/平方厘米的紫外交联仪处理I分钟固定染色体，在染色体位置加5微升的探针，其质量不超过100纳克，盖上盖玻片，放入密闭保湿的饭盒中，在沸水中煮沸15分钟，迅速冷却变性的染色体和探针； S4:杂交与杂交后洗脱，遮光变性的玻片和探针，取出玻片放入55°C烘箱中，经过大于4小时的保温复性杂交，取出玻片置于含2 X SSC溶液的玻片染色缸中，室温漂洗5分钟，去除玻片，接着转至另一含2 X SSC溶液的玻片染色缸，55°C漂洗25分钟，取出玻片，空气晾干后保湿； S5:制片与信号检测，在制备好的玻片上滴加荧光染料5微升DAPI和5微升2 X SSC溶液，盖上盖玻片，在盖玻片上覆上吸水纸，用橡皮敲打1-2分钟，使用德国DM750M徕卡金相显微镜观察，找到良好的染色体分裂相，用不同的激发光获得，蓝色，红色和绿色的杂交信号；用Lecia CW4000 FISH software进行图像米集与合成。3.如权利要求1所述的蒙古沙冬青染色体荧光原位杂交的方法，其特征在于，所述步骤S2中的Nick translat1n法制备探针，成分为:DNA (200纳克/毫升)，10.0微升；10 XNicktranslat1n缓冲液，2.0微升；荧光标记的dNTP( ImM)，0.5微升；无荧光标记的dNTPs(2mM)，2.0微升;DNA聚合酶I(1U/微升)，8.0微升;DNase (100 mU/微升)，0.4微升;总体积22.9微升；制备方法为:混合物混匀后放入PCR仪15° C保温2小时；加入175微升的含140纳克/微升鲑鱼精DNA的5 X TAE pH 5.2终止反应，并混匀，加入500微升大于2小时沉淀探针后16000rpm;离心30分钟，70%乙醇洗涤2遍，加入100微升的2 X SSC溶解探针，使探针终浓度为20纳克/微升，_20°C避光储存备用。4.如权利要求1所述的新疆沙冬青染色体荧光原位杂交的方法，其特征在于，所述蒙古沙冬青的核型模式为2n = 2x =18= 2sm(SAT)+ 6 m + 8 sm + 2st。
【专利摘要】本发明涉及细胞遗传学与分子生物学技术领域，具体涉及一种蒙古沙冬青染色体荧光原位杂交的方法。通过制备染色体玻片标本、18SrDNA、5SrDNA和端粒探针制备与探针变性、探针与染色体共变性、杂交与杂交后洗脱、制片与信号检测步骤，建立蒙古沙冬青染色体荧光原位杂交技术，本发明是一种快速、精确的染色体荧光原位杂交技术，观察到分散好、荧光信号强的染色体分裂相，能更好地辨析蒙古沙冬青染色体，以应用于蒙古沙冬青的核型分析与进化研究。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105567860
【申请号】CN201610145574
【发明人】唐宁, 张边江, 陈全战
【申请人】南京晓庄学院
【公开日】2016年5月11日
【申请日】2016年3月15日