癌细胞株DU145(ATCC-HTB-81)。化 合物⑴自制，HPLC归一化纯度大于98%，用二甲基亚矾(DMS0)配制成浓度为1.0g/L的储存 液备用。CCK-8试剂盒为日本同仁化学研究所产品。RPMI-1640培养基购自Gibco公司。胎牛 血清(FBS)购自Hyelone公司。青/链霉素为上海先锋药业产品。胰蛋白酶购自华美生物工程 公司。二甲基亚砜(DMS0)购自上海华舜生物工程公司。琼脂(Agarose)、二硫苏糖醇(DTT)、 苯甲基磺酞氟(PMSF)、四甲基乙二胺(TEMED)为Sigma公司产品。十二烷基磺酸钠(SDs)、三 氯甲基烷基甲烧(1'1^8)1'1^8-!1(31、1'1'；[1：01^-100为?1'0111683公司产品。丙稀酞胺、过硫酸钱 (AP)购于苏州化学试剂厂产品。
[0031 ] C02细胞培养箱(ShellLab)，倒置相差显微镜(Nikon)，超净工作台（苏州净化设备 厂），流式细胞仪（BD)，F039300A型酶标仪（Sunrise)，高压蒸汽灭菌器（Hirayama HA-300MD)，低温超速离心机(Kubota 3740)，万向摇床(江苏麒麟医用仪器厂TS-92)，电泳仪 (Gibco公司），LXJ-n型离心机(上海医用分析仪器厂），DK600型电热恒温水浴箱(上海精密 试验设备公司），电子天平(METTLER TOLEDO)，台式干燥箱（上海森信实验仪器有限公司）， 紫外分光光度仪(Beckman)。
[0032]二、试验方法
[0033] 1、细胞培养与养护
[0034] 1.1细胞培养
[0035]细胞株培养于肿瘤医院中心实验室。培养于含10 %胎牛血清的RPMI-1640培养基 中，另添加谷氨酞胺(2mmo 1/L)和抗生素（100U/青霉素和100mg/L链霉素），置37°C、饱和湿 度、含5 % C〇2气体的培养箱中培养。
[0036] 1.2细胞传代
[0037]①于倒置相差显微镜下观察细胞长满贴壁，即可传代。传代前用75%酒精擦拭经 过紫外线照射的超净工作台和双手。②用吸管吸去培养瓶中的旧培养液，用PBS清洗3次。③ 加入0.02 %EDTA-0.25%胰蛋白酶液2mL进行消化，静置约5分钟，并不时在倒置相差显微镜 下观察，当胞质回缩，细胞之间不再连接成片时，加入适量含血清之新鲜培养基终止胰蛋白 酶的作用。④用滴管将已经消化的细胞吹打成细胞悬液，吸入10mL离心管中平衡离心（1000 转/分)5分钟。⑤弃去上清液，加入2mL培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液，1:2~3 分装入新培养瓶，添加培养液适量于孵箱中继续培养。
[0038] 2、细胞形态学观察
[0039] 倒置显微镜观察：将对数生长期PC3和DU145细胞接种于6cm培养皿，培养24h后加 入10.Omg · Γ1，化合物（I)处理24,48，72h后分别在倒置相差显微镜下观察细胞形态改变并 记录。
[0040] 3、细胞毒试验(CCK-8法）
[0041] ①培养瓶中的细胞消化成单细胞悬液，细胞计数后按照3 X104个细胞/孔接种于 96孔板，每孔加0. lmL培养基，常规培养于37 °C、含5 %C02气体的培养箱中。②试验分组:设 阴性对照组(有细胞但不加药，0.1%DMS0)，空白对照组(无细胞仅有培养液），化合物（I)分 别2 · 5mg/L，5 · Omg/L，10 · Omg/L和20 · Omg/L共6组。③24小时后观察细胞贴壁生长良好，分别 按上述试验分组向96孔板内加药，每组设6-8个重复孔。④加药后将96孔板移入37°C、含5% C02气体的培养箱中继续分别培养24、48和72小时。⑤每组试验结束时每孔加入CCK-810yL， 37 °C培养箱中继续培养4小时后酶标仪检测450每孔的吸光度(0D)值，测定波长为450nm，参 考波长为600nm。⑥按照以下公式计算出细胞存活率(cell viability)，然后绘制成图表， 存活率为50%时的值即为IC5Q。细胞存活率（％ ) = [ (As-Ab)/(Ac-Ab) ] X 100%。其中As为试 验孔，Ac为对照孔，Ab为空白孔。
[0042] 4、集落形成试验
[0043]①取对数生长期细胞，计数后以3 X 102个接种于6孔板，每孔加2mL培养基，常规培 养于37°C、含5%C02气体的培养箱中。②24h后观察细胞贴壁生长良好，分别加入不同浓度 (0，2.5，5.0，10.0，20.0 mg/L)化合物（I)处理，每组设3个重复孔。③加药后将6孔板移入37 °C、含5%C〇2气体的培养箱中继续14天。④10%甲醇固定，Giemsa染色，计算每孔集落数（> 50个细胞的计为一个集落）。⑤计算集落形成率:集落总数/接种细胞数X 100%。
[0044]三、结果及结论
[0045] 1、化合物（I)气对PC3和DU145细胞形态的影响
[0046]镜下见对照组细胞贴壁生长，相邻细胞融合成片，细胞呈类圆形或梭形，体积较 大，排列紧密，边缘光滑，胞质饱满，核膜、核仁等结构轮廓明显，细胞生长迅速;经10.〇mg/L 化合物（I)处理后，细胞密度逐渐降低，生长速度明显减慢至几乎停滞，细胞逐渐脱落并漂 浮于培养液中。细胞体积缩小，胞膜皱缩，成小圆形或不规则形态，胞内多见小颗粒状物质。 药物作用时间越长，细胞形态学改变越明显。
[0047] 2、细胞毒试验
[0048]不同浓度化合物（I)对前列腺癌细胞株PC3和DU145的生长均有抑制作用。2.5， 5.0，10.0，20.0 mg/L化合物（I)作用两种细胞24，48和72h后的存活率如下表所示(表1及表 2)。其中，10 . Omg/L化合物（I)作用于PC3和DU145细胞24，45，72h后的细胞存活率分别为 56.2%，42.5%，24.3%和50.8%，32.6%，20.7% ;2.5,5.0，10.0,20.011^/1，化合物（1)作 用两种细胞72h后的存活率分别为54.3%，37.7%，24.3%，13.2%和52.4%，32.8%， 20.7%，11.2% (见图3及图4)。两因素方差分析示不同浓度与不同时间处理组之间差别具 有统计学意义(P〈〇.〇5)，提示化合物（I)对PC3和DU145的生长抑制作用呈时间浓度依赖。 [0049] 3、集落形成试验
[0050] 试验显示，对照组PC3和DU145的集落形成率分别为67.7和64%，而2.5，5.0，10.0， 20.011^/1化合物（1)处理组分别为60.7%，51.3,39.3%，27.0%和49.7%，34.0%，27.7%， 15.7% (见表3)。这进一步证实了化合物（I)对PC3和DU145细胞具有增殖抑制作用。
[0051 ]结论，本试验中通过CCK-8法和集落形成试验来验证化合物（I)对前列腺癌细胞株 PC3和DU145的作用，且抑制作用具有浓度一一时间依赖性关系。化合物（I)可能成为晚期前 列腺癌治疗中的一个具有潜力的选择。
[0052 ]表1不同浓度化合物(I)作用于PC3后的细胞存活率
[0053]
[0054] 表2不同浓度化合物（I)作用于DU145后的细胞存活率
[0055]
[0056] 表3不同浓度化合物(I)作用下PC3和DU145的集落形成率
[0057]
[0058] 实施例3
[0059] 片剂的制备:按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬 酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按其与赋形剂重量比为1:9的 比例加入赋形剂，制粒压片。
[0060] 实施例4
[0061] 口服液制备:按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬 酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按常规口服液制法制成口服 液。
[0062] 实施例5
[0063] 胶囊剂或颗粒剂的制备：按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒 石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按其与赋形剂重 量比为1:9的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂。
[0064] 实施例6
[0065] 注射液的制备:按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠 檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按常规加注射用水，精滤， 灌封灭菌制成注射液。
[0066] 实施例7
[0067] 无菌粉针的制备:按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒石酸、或 柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，将其溶于无菌注射用水 中，搅拌使溶，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于安瓿中，低温冷冻干燥后无菌熔封 得粉针剂。
[0068] 上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护 范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换， 而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。
【主权项】
1. 具有下述结构式的化合物α)，2. 权利要求1所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于包含以下操作步骤：（a)将干燥 的茵陈粉碎，用75~85%乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸 乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物； (b)步骤(a)中乙酸乙酯萃取物用大孔树脂除杂，先用10%乙醇洗脱8个柱体积，再用75%乙 醇洗脱12个柱体积，收集75%乙醇洗脱液，减压浓缩得75%乙醇洗脱物浸膏；（c)步骤(b)中 75 %乙醇洗脱物浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为80:1、50:1、30:1、15:1和1:1的二氯 甲烷-甲醇梯度洗脱得到5个组分；（d)步骤(c)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积 比为20:1、15:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤(d)中组分2用十八 烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为75 %的甲醇水溶液等度洗脱，收集8~10 个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(I)。3. 根据权利要求2所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于：步骤(a)中，用80%乙醇 热回流提取，合并提取液。4. 根据权利要求2所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于:所述大孔树脂为AB-8型 大孔吸附树脂。5. -种药物组合物，其特征在于:该药物组合物含有治疗有效量的权利要求1所述的化 合物(I)和药学上可接受的载体。6. 权利要求1所述的化合物（I)在制备治疗前列腺癌的药物中的应用。7. 权利要求5所述的药物组合物在制备治疗前列腺癌的药物中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种三萜化合物、制备方法和治疗前列腺癌的医药用途。该化合物为首次报道，是一种结构新颖的三萜类化合物，可以从干燥的茵陈中提取、分离纯化得到。体外试验证明该化合物对前列腺癌细胞株PC3和DU145有抑制作用，且抑制作用具有浓度——时间依赖性关系。化合物(Ⅰ)可能成为晚期前列腺癌治疗中的一个具有潜力的选择，可以用来开发成治疗前列腺癌的药物。
【IPC分类】C07J21/00, A61P35/00, A61P13/08, A61K31/585
【公开号】CN105601695
【申请号】CN201511022691
【发明人】吴金凤
【申请人】吴金凤
【公开日】2016年5月25日
【申请日】2015年12月30日