A序列克隆入线性化慢病 毒质粒载体pLVX-IRES-ZsGreenl，命名为pLVX-sh0ct4-ZsGreenl 〇
[0045] 0ct4shRNA颈环结构对应的DNA序列如下：
[0046] 5 '-CTCGAGCCCTCACTTCACTGCACTGCCATTG-3 '。
[0047] (2)将含有目的基因的慢病毒转染UC-MSCs。
[0048] 1)慢病毒的制备。
[0049] A、接种人肾上皮细胞系293T细胞(购自上海酶研生物科技有限公司）于多聚赖氨 酸处理的100mm培养皿中，当细胞融合度达到80%时换液，将三质粒(pspaxSjMDSGALVX-OctfZsGreenl 或者 pLVX-sh0ct4-ZsGreenl) 共转染 293T 细胞 ，培养 6h 后更换培养基； pspax2和pMD2G购买于优宝生物；
[0050] B、转染48h后收集病毒上清液，于4°C、4000r/min离心10min;收集离心后的上清液 并过滤；
[0051 ] C、4°C、25000r/min离心2h后用无血清培养液溶解病毒沉淀；
[0052] D、使用有限稀释法测定病毒滴度，分装保存于-80°C冰箱中备用。
[0053] 2)慢病毒的转染。
[0054]将脐带间充质干细胞(UC-MSCs，上海拜力生物科技有限公司）接种于六孔板中，当 单层细胞生长密度达到80%~90%时加入lml步骤1)得到的慢病毒颗粒(滴度为6 X107TU/ ml )，并加入聚凝胺至终浓度为8μg/ml以促进病毒吸附。按照以下3组进行转染:对照为转染 空质粒的 UC-MSCs，0ct4为转染0ct4 质粒（即 pLVX-0ct4-ZsGreenl)的 UC-MSCs，sh0ct4 为转 染0ct4shRNA的UC-MSCs(即pLVX-sh0ct4-ZsGreenl)〇 [0055] (3) RT-PCR方法检测IL-31基因表达。
[0056] 1)抽提细胞总RNA。
[0057] 转染72小时后，分别从上述3组UC-MSCs中抽提细胞总RNA，按E. Z. N.A. Total RNA Kit I试剂盒(购自广州飞扬生物有限公司)使用步骤完成。
[0058] 2)总RNA反转录得到cDNA。
[0059] 反转录试剂盒购自大连宝生物工程有限公司，反转录体系如下：
[0060]
[0061 ] 70°C上加热lOmin后迅速置冰上至少2min。接着在上述混合液中加入如下体系的 混合液1〇μ1，42°C保温lh，70°C保温15min，得到cDNA。
[0062]
[0063] 3)PCR 检测 IL-31 的表达。
[0064] 扩增E-31的引物序列如下：
[0065] 几 -31上游引物：5'-〇八〇6176〇01^01；1'7^-3'；
[0066] 几 -31下游引物：5'-1'7^6丁6〇6厶66丁0^丁6-3'。
[0067] PCR扩增的反应体系如下：
[0068]
[0069] PCR扩增的反应条件如下：
[0070]
[0071]最后对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定并拍照。
[0072] 实验结果显示：UC-MSCs能够表达IL-31mRNA，0ct4基因能够增加 IL-31的表达， sh0ct4通过降解细胞内源性0ct4mRNA，导致细胞内IL-31表达的降低（图1)。
[0073]实施例2采用CHIP(染色质免疫共沉淀)方法鉴定在不同代数的MSCs中0ct4与IL-31基因的启动子结合情况。
[0074]实验步骤按CHIP试剂盒说明书进行，略有改动，CHIP试剂盒购自武汉艾美捷科技 有限公司
[0075] (1)将不同代数的UC-MSCs (P3、P6、P9)分别经过1 %甲醛交联固定，室温下放置 lOmin，用甘氨酸溶液中止反应；
[0076] (2)然后用预冷的PBS洗涤细胞两次，离心去上清后加入lml含蛋白酶抑制剂的SDS 裂解液裂解细胞；
[0077] (3)超声断裂细胞裂解液中的染色质DNA，采用蛋白G磁珠去除非特异性结合的DNA 片段；
[0078] (4)在剩余上清液中加入抗0ct4抗体，加入小鼠 IgG抗体作为阴性对照；
[0079] (5)加入蛋白G磁珠，收集蛋白G磁珠/抗0ct4抗体/0ct4/DNA片段的复合物；
[0080] (6)经过解交联后获得游离DNA片段，用DNA纯化柱回收DNA片段。
[00811 (7)然后以回收的DNA为模板，采用Real-time PCR的方法扩增IL-31基因的启动子 片段，IL-31启动子上下游引物用Primer 5.0软件设计，由上海生工生物公司合成，引物的 序列如下：
[0082] 几 -31启动子上游引物：5'-〇60^^(^6(：1'(：1'1'1'(^0：1'-3'；
[0083] 几 -31启动子下游引物：5'-66666了六6了6(：11'0^6六六1'-3'。
[0084] Real-time PCR反应体系如下：
[0085]
[0086] Real-time PCR反应程序如下：
[0087]
[0088] (8)用Δ Δ Ct值进行相对定量。
[0089]实验结果显示：采用抗0ct4抗体沉淀的UC-MSCs的染色质DNA片段中，能特异性地 扩增出含有〇ct4结合位点的IL-31基因启动子片段，采用正常小鼠 IgG抗体作为阴性对照组 则不能扩增此片段。随着UC-MSCs传代数增加，PCR扩增量也减少。此结果表明：0ct4能够与 IL-31基因启动子结合，从而调节IL-31的表达，IL-31是0ct4的新靶基因（图2)。
[0090]实施例3采用双荧光素酶报告基因系统检测0ct4对IL-31基因表达的调控作用。 [0091] (1)构建含IL-31启动子的质粒。
[0092] 1)合成含有Xhol(tcgag)和Hind Ill(agctt)酶切位点的IL-31启动子DNA，模板链 (正义链)的序列如下：
[0093] 5，-GCTCGAGAGGCGAACACATCTGGCTCCAAGCTTCG-3，。
[0094] 2)将IL-31 启动子DNA 和pGL3_Lucif erase质粒（Promega)分别进行 Xhol和 Hind III双酶切，IL-31启动子DNA双酶切条件如下：
[0095]
[0096] pGL3_Luciferase质粒双酶切条件如下：
[0097]
[0098] 3) 37 °C酶切过夜后，于1 %琼脂糖凝胶电泳，并分别回收酶切后的IL-31启动子DNA 和 pGL3_Luciferase 质粒；
[0099] 4)将IL-31启动子双酶切回收产物连接到pGL3-Luciferase双酶切回收产物内，得 到重组的pGL3_IL_31启动子-Luciferase质粒。16°C连接2h，连接体系如下：
[0100]
[0101] 5)将此重组的PGL3-IL-31启动子-Luciferase质粒转化大肠杆菌DH5a感受态细 胞，获得DH5a重组克隆，挑取一些克隆进行阳性鉴定，将挑选的阳性克隆于上海生工生物公 司进行测序。测序结果显示其核苷酸序列全部正确，得到PGL3-IL-31启动子-Luciferase。
[0102] (2)双荧光素酶报告基因系统检测0ct4对IL-31基因表达的调控作用。
[0103] 1)将含有0ct4、sh0ct4和空质粒的慢病毒分别转染至UC-MSCs，同时转入萤火虫荧 光素酶质粒PGL3-IL-31启动子-Luciferase和海肾荧光素酶质粒pGL4-Renilla(pGL3-Luciferase和pGL4_Renilla购买于广州佰路生物技术有限公司），pGL4_Renilla作为转染 效率内参对照。采用不含有IL-31启动子的质粒pGL3-Luc i f eras e作为对照。
[0104] 2)24h后分别收集转染细胞，用被动裂解液(Promega公司）裂解细胞，使用Promega 公司的双荧光素酶报告基因分析试剂盒和GloMax 2/20发光检测仪测定荧光值。结果代表 萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶活性比率的平均值。
[0105] 实验结果显示：在UC-MSCs内转录因子0ct4能够与IL-31基因的启动子结合，从而 促进萤火虫荧光素酶的表达。sh0ct4通过降解细胞内源性0ct4mRNA，从而抑制萤火虫荧光 素酶的表达(图3)。
[0106] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.0ct4在调控IL-31基因表达中的应用。2. 根据权利要求1所述的0ct4在调控IL-31基因表达中的应用，其特征在于:所述的IL-31基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。3. 根据权利要求1所述的0ct4在调控IL-31基因表达中的应用，其特征在于：是将0ct4 蛋白或是能表达0ct4的核酸序列制备成活化IL-31基因转录的药物。4. 根据权利要求1所述的0ct4在调控IL-31基因表达中的应用，其特征在于：是将0ct4 蛋白或是能表达0ct4的核酸序列制备成治疗皮肤炎症的药物。5. 根据权利要求3或4所述的0ct4在调控IL-31基因表达中的应用，其特征在于:所述的 核酸序列为DNA序列。
【专利摘要】本发明公开了Oct4在调控IL-31基因表达中的应用。本发明是基于本发明发明人首次发现转录因子Oct4在间充质干细胞内能结合并活化其新靶基因IL-31的成果。本发明采用染色质免疫共沉淀和双荧光素酶报告基因系统检测的方法证明了在间充质干细胞内转录因子Oct4能够与IL-31基因的启动子特异性结合，并能够活化IL-31基因的转录。因此，这些研究结果将为研究转录因子Oct4对其新靶基因IL-31的表达调控机理提供理论基础，将为Oct4和IL-31应用于皮肤炎症等疾病的治疗中奠定必要基础。
【IPC分类】A61K48/00, A61K38/17, A61P17/00, C07K14/47
【公开号】CN105601726
【申请号】CN201610076404
【发明人】魏星, 梁广铨
【申请人】暨南大学
【公开日】2016年5月25日
【申请日】2016年2月3日