自疫苗毒株或者其可来自不同的流感病毒毒株。
[0060] 一种或多种重配流感病毒的主链区段（即编码PBl、PB2、PA、NP、Ml、M2、NSl和NS2的 那些)可来自供体毒株，该供体毒株是提供一个或多个主链区段但是不提供流感病毒HA区 段的胞外域的流感病毒。NA区段的胞外域还可由供体毒株提供或者其可由疫苗毒株提供。 本发明的重配流感毒株还可包含一种或多种(但不是全部)来自疫苗毒株的主链区段。
[0061] 供体毒株可W与"第二流感病毒毒株"相同，其提供嵌合HA或NA区段的一个或多个 末端结构域。在运些重配流感病毒中，PA、M和/或NS区段优选来自第二流感病毒。第二流感 病毒也可与供体毒株不同。
[0062] 与野生型疫苗毒株相比，在相同的时间（例如12小时、24小时、48小时或72小时）内 且在相同生长条件下，该重配流感病毒可在细胞培养物和/或鸡蛋中生长至较高或类似的 病毒效价。具体而言，与野生型疫苗毒株相比，在相同的时间内且在相同生长条件下，其可 在MDCK细胞（如MDCK33016)中生长至较高或类似的病毒效价。可通过本领域技术人员已知 的标准方法测定病毒效价。有用地，在相同时间框内且在相同条件下，本发明的重配病毒能 达到的病毒效价比野生型疫苗毒株的病毒效价高出至少5%、至少10%、至少20%、至少 50%、至少100%、至少200%或至少500%。另外，或者替代地，本发明的重配流感病毒可实 现比除了没有嵌合HA或NA区段W外包含相同病毒区段的重配流感病毒的病毒效价高至少 5%、至少10%、至少20%、至少50%、至少100%、至少200%、或至少500%的病毒效价。
[0063] 与野生型疫苗毒株相比，在相同的时间内且在相同生长条件下，该重配流感病毒 还可生长至类似病毒效价。此时类似效价指重配流感病毒所生长至的效价是在相同时间内 且在相同生长条件下野生型疫苗毒株所能达到的病毒效价的3% W内（即野生型效价± 3%)〇
[0064] 与野生型疫苗毒株相比，重配病毒也能获得在相同时间（例如12小时、24小时、48 小时或72小时）和相同生长条件下于细胞培养物和/或鸡蛋中高至少2倍、至少3倍、至少4 倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或至少10倍的HA产率。
[0065] 当本发明的重配病毒是包含来自单一供体毒株的主链区段的重配株时，该重配病 毒包含的供体毒株与疫苗毒株的区段比通常是1:7、2:6、3:5、4:4、5:3、6:2或7:1。经典重配 体通常具有来自供体毒株的大部分区段，特别是6:2的比率。在仅使用单个供体毒株的情况 中，优选所有的主链区段来自PR8-X，因为运类重配流感病毒在细胞培养中生长快速。
[0066] 本发明的重配病毒可含有来自巧巾或更多种（即，3、4、5或6种)供体毒株的主链。当 所述重配病毒包含来自两种供体毒株的主链区段时，所述重配病毒通常W1:1:6、1: 2:5、1: 3:4、1:4:3、1:5:2、1:6:1、2:1:5、2:2:4、2:3:3、2:4:2、2:5:1、3:1:2、3:2:1、4:1:3、4:2:2、4 :3:1、5:1:2、5:2:1或6:1:1的比例包含来自第一供体毒株、第二供体毒株和疫苗毒株的区 段。该重配流感病毒还可包含来自超过两种(例如来自=种、四种、五种或六种)供体毒株的 病毒区段。
[0067] 当该重配流感病毒包含来自两种或=种供体毒株的主链区段时，各供体毒株可提 供超过一种的重配流感病毒主链区段，但该供体毒株中的一或两种也可仅提供单一的主链 区段。
[0068] 当该重配流感病毒包含来自二、=、四或五种供体毒株的主链区段时，该供体毒株 中的一种或两种可提供超过一种的重配流感病毒主链区段。通常，重配流感病毒不可包含 超过六种主链区段。因此，例如，若一种供体毒株提供五种病毒区段，则该重配流感病毒仅 能包含来自总共两种不同供体毒株的主链区段。
[0069] 通常，重配流感病毒会仅包含各主链区段之一。例如，当流感病毒包含来自A/ 化lifornia/07/09的NP区段时，其将不同时包含来自另一流感毒株的NP区段。
[0070] 重组流感病毒可包含来自甲型流感病毒毒株的HA胞外域。例如，重配流感病毒可 包括甲型流感病毒 HA 亚型 H1、H2、H3、H4J5、H6、H7、WJ9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16 或H17。另外，或替代地，重配流感病毒可包含来自甲型流感病毒的NA胞外域。例如，其可含 有甲型流感病毒NA亚型N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8或N9。当该疫苗毒株是季节性流感毒株 时，其可具有化或册亚型。在本发明的一个方面中，该疫苗毒株是化Nl、册肥或H7N9毒株。
[0071] 该重配流感病毒优选包含至少一个来自供体毒株PR8-X的主链区段。因此，本发明 的流感病毒可包含一种或多种选自下组的区段:与SEQ ID N0:9的序列具有至少95%、至少 96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同性的PA区段，与沈Q ID NO: 10的序列具有 至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同性的PBl区段，与SEQ ID NO: 11的序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同性的PB2 区段，与SEQ ID NO: 12的序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或 100%相同性的NP区段，与SEQ ID NO: 13的序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少 98%、至少99%或100%相同性的M区段，和/或与SEQ ID NO: 14的序列具有至少95%、至少 96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同性的NS区段。该重配流感病毒可包含所有 运些主链区段。运是特别优选的，因为发明人已经发现包含嵌合HA和/或NA区段与该主链的 重配流感病毒在细胞培养物中生长得特别好。
[0072] 或者，或此外，该重配流感病毒可包含来自105p30毒株的一种或多种主链病毒区 段。因此，在该重配流感病毒包含一个或多个来自105p30毒株的区段时，病毒区段可含有选 自下组的序列：与沈Q ID NO: 42的序列具有至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %、至少 99%或100%相同性的PA区段，与沈Q ID N0:43的序列具有至少95%、至少96%、至少97%、 至少98%、至少99%或100%相同性的PBl区段，与沈Q ID N0:44的序列具有至少95%、至少 96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同性的PB2区段，与SEQ ID N0:45的序列具 有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同性的NP区段，与SEQ ID N0:46的序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同性的M区 段，和/或与SEQ ID N0:47的序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99% 或100%相同性的NS区段。该重配流感病毒可包含所有运些主链区段。
[0073] 具有来自两种或更多种流感病毒供体菌株的主链区段的重配甲型流感病毒可包 含来自不同流感病毒毒株的HA区段和PBl区段。在运些重配流感病毒中，PBl区段可来自与 疫苗菌株具有相同流感病毒HA亚型的供体病毒。例如，PBl区段和HA区段都可来自具有Hl亚 型的流感病毒。该重配流感病毒还可包含来自具有不同流感病毒HA亚型的不同流感病毒的 HA区段和PBl区段，其中PBl区段不是来自具有H3HA亚型的流感病毒和/或HA区段不是来自 具有Hl或册HA亚型的流感病毒。例如，PBl区段可来自Hl病毒和/或HA区段可来自册流感病 毒。当该重配株包含来自超过一种流感供体毒株的病毒区段时，其它供体毒株可W是任何 供体毒株。例如，一些病毒区段可W来自A/化erto Rico/8/34或A/Ann Arbor/6/60流感毒 株。包含来自A/Ann Arbor/6/60毒株的病毒区段的重配株是有利的，例如，该重配病毒可W 活减毒疫苗的形式使用。
[0074] 该重配流感病毒还可包含来自两种或更多种流感供体毒株的主链片段，其中PBl 区段来自A/California/07/09流感毒株。该区段可与SEQ ID N0:24的序列具有至少95%相 同性、至少96 %相同性、至少97 %相同性、至少98%相同性、至少99 %相同性或100%相同 性。该重配流感病毒可具有HlHA亚型。应理解，本发明的该方面所述的重配流感病毒将不包 含来自A/California/07/09的HA和/或NA区段。
[0075] 该重配流感毒株可包含来自A/tal if ornia/4/09毒株的HA胞外域和/或NA胞外域。 因此，例如，HA基因区段可编码Hl血凝素，其胞外域与SEQ ID N0:70的相关性高于与SEQ ID N0:50的相关性（即使用相同算法和参数，与SEQ ID N0:70相比的序列相同性高于与SEQ ID NO:50的相同性KSEQ ID NO:70和50有80%相同性。相似地，NA基因可编码Nl神经氨酸巧 酶，其与沈Q ID NO:99的相关性比SEQ ID NO:51更紧密。沈Q ID NO:99和51具有82%相同 性。
[0076] 该重配流感病毒可包含至少一种来自A/化lifornia/07/09流感毒株的主链病毒 区段。当该至少一种主链病毒区段是PA区段时，其序列可与SEQ ID N0:23的序列具有至少 95%、至少96%、至少97%或至少99%相同性。当该至少一种主链病毒区段是PBl区段时，其 序列可与沈Q ID N0:24的序列具有至少95%、至少96%、至少97%或至少99%相同性。当该 至少一种主链病毒区段是PB2区段时，其序列可与SEQ ID N0:25的序列具有至少95%、至少 96%、至少97%或至少99%相同性。当该至少一种主链病毒区段是NP区段时，其序列可与 SEQ ID N0:26的序列具有至少95%、至少96%、至少97%或至少99%相同性。当该至少一种 主链病毒区段是M区段时，其序列可与SEQ ID N0:27的序列具有至少95%、至少96%、至少 97%或至少99%相同性。当该至少一种主链病毒区段是NS区段时，其序列可与SEQ ID NO: 28的序列具有至少95%、至少96%、至少97%或至少99%相同性。
[0077] 当重配流感病毒包含来自A/Texas/1/77的PBl区段时，其优选不包含来自A/ 化erto Rico/8/34的PA、NP或M区段。当重配甲型流感病毒包含来自A/化erto Rico/8/34的 PA、NP或M区段时，其优选不包含来自A/Texas/1/77的PBl区段。在一些实施方式中，本发明 不包括具有来自A/Texas/1/77的PBl区段和来自A/化erto Rico/8/34的PA、NP和M区段的重 配流感病毒。来自A/Texas/1/77的PBl蛋白可具有SEQ ID N0:29的序列且来自A/化erto Rico/8/34的PA、NP或M蛋白可分别具有沈Q ID NO 30、31或32的序列。
[0078] 特别优选的是包含本发明的嵌合HA和/或NA区段(优选同时包含），来自105p30的 NP、PB巧日PB2区段W及来自PR8-X的M、NS和PA区段的重配流感病毒。特别优选的是包含本发 明的嵌合HA和/或NA区段(优选同时包含），来自A/California/4/09的PB 1区段W及来自 PR8-X的其他主链区段的重配流感病毒。运类重配流感病毒是优选的，因为发明人已经发现 它们在细胞培养物中生长非常良好并提供非常好的HA产率。
[0079] 主链病毒区段可编码经优化W在特定的培养宿主中培养的病毒蛋白质。例如，当 重配流感病毒在哺乳细胞中培养时，使至少一种病毒区段适应培养宿主中的最佳生长是有 利的。例如，当表达宿主是犬细胞(如MDCK细胞系）时，病毒区段可编码含有优化细胞中病毒 生长的序列的蛋白质。因此，本发明的重配流感病毒可包含编码PB2蛋白的PB2区段，其在使 用成对比对算法与SEQ ID NO:3比对时在对应于SEQ ID NO:3的氨基酸389的位置处具有赖 氨酸，和/或在使用成对比对算法与SEQ ID NO:3比对时在对应于SEQ ID NO:3的氨基酸559 的位置处具有天冬酷胺。根据本发明，还提供了重配流感病毒，其中PA区段编码PA蛋白，该 蛋白使用成对比对算法与SEQ ID NO: 1比对，则在对应于SEQ ID NO: 1的氨基酸327的位置 处具有赖氨酸，和/或使用成对比对算法与SEQ ID NO: 1比对，则在对应于SEQ ID NO: 1的氨 基酸444的位置处具有天冬氨酸，和/或使用成对比对算法与SEQ ID NO: 1比对，则在对应于 SEQ ID NO: 1的氨基酸675的位置处具有天冬氨酸。本发明的重配流感毒株还可具有编码NP 蛋白的NP区段，该NP蛋白使用成对比对算法与SEQ ID NO:4比对，则在对应于SEQ ID NO:4 的氨基酸27的位置处具有苏氨酸，和/或使用成对比对算法与SEQ ID NO:4比对，则在对应 于SEQ ID N0:4的氨基酸375的位置处具有天冬酷胺。变体流感毒株还可包含两个或更多个 运些突变。优选地，变体流感病毒含有同时具有上述两种氨基酸变化的变体PB2蛋白，和/或 同时含有S种上述氨基酸变化的PA蛋白，和/或同时含有两种上述氨基酸变化的NP蛋白。该 流感病毒可W是化毒株。
[0080] 或者或此外，该重配流感病毒可包含编码PBl蛋白的PBl区段，该PBl蛋白使用成对 比对算法与SEQ ID NO:2比对，则在对应于SEQ ID NO:2的氨基酸200的位置处具有异亮氨 酸，和/或使用成对比对算法与SEQ ID NO:2比对，则在对应于SEQ ID NO:2的氨基酸338的 位置处具有天冬酷胺，和/或使用成对比对算法与SEQ ID NO: 2比对，则在对应于SEQ ID NO:2的氨基酸529的位置处具有异亮氨酸，和/或使用成对比对算法与SEQ ID NO:2比对，贝U 在对应于SEQ ID N0:2的氨基酸591的位置处具有异亮氨酸，和/或使用成对比对算法与SEQ ID NO:2比对，则在对应于SEQ ID NO:2的氨基酸687的位置处具有组氨酸，和/或使用成对 比对算法与SEQ ID NO:2比对，则在对应于SEQ ID NO:2的氨基酸754的位置处具有赖氨酸。
[0081] 本发明方法中所用供体毒株的选择可取决于待重配的疫苗毒株。由于远进化距离 间的重配株在细胞培养中可能无法良好复制，因此供体毒株和疫苗毒株可能具有相同HA 和/或NA亚型。然而，在其它实施方式中，疫苗毒株和供体毒株可具有不同HA和/或NA亚型， 而运种配置可有利于选择包含来自该疫苗毒株中HA和/或NA区段的重配毒株。因此，虽然 105p30和PR8-X毒株含有化流感亚型，运些供体毒株可用于不含有化流感亚型的疫苗毒株。
[0082] 因此，流感病毒可包含来自105p30或PR8-X毒株的一种、两种、S种、四种、五种、六 种或屯种病毒区段和非化亚型的HA区段。该重配供体毒株还可包含不是Nl亚型的NA区段。
[0083] 可用作疫苗毒株的毒株包括对抗病毒治疗有抗性(例如对奥塞米韦[引和/或扎那 米韦有抗性)的毒株，包括抗性大流行毒株[9]。
[0084] 重配流感病毒可W是乙型流感病毒。例如，重配流感病毒可包含来自第一乙型流 感病毒的HA胞外域和来自第二乙型流感病毒的NP和/或PB2区段，该第二乙型流感病毒是B/ Victoria/2/87 样毒株。该 B/Victoria/2/87 样毒株可 W 是 B/化 isbane/60/08。
[0085] 重配乙型流感病毒可包含来自第一乙型流感病毒的HA胞外域和来自第二乙型流 感病毒的NP区段，该第二乙型流感病毒不是B/Lee/40或B/Ann Arbor/1/66或B/hnama/45/ 90。例如，该重配乙型流感病毒可具有不具有SEQ ID N0:80、100、103或104的序列的NP区 段。该重配乙型流感病毒还可具有不编码SEQ ID NO: 19、23、44或45的蛋白的NP区段。该重 配乙型流感病毒可包含来自第二乙型流感病毒的NP和PB2区段。该第二乙型流感病毒优选 是 B/Victoria/2/87 样毒株。该 B/Victoria/2/87 样毒株可 W 是 B/化 isbane/60/08。
[0086] 该重配乙型流感病毒可包含来自B/Yamagata/16/88样毒株的HA胞外域和来自B/ Victoria/2/87样毒株的至少一个主链区段。该重配乙型流感病毒可包含两个、S个、四个、 五个或六个来自B/Victoria/2/87样毒株的主链区段。在优选的实施方式中，该重配乙型流 感病毒包含所有来自B/Victoria/2/87样毒株的主链区段。该B/Victoria/2/87样毒株可W 是B/化isbane/60/08。
[0087] 该重配乙型流感病毒可包含来自B/Victoria/2/87样毒株和B/Yamaga化/16/88样 毒株的病毒区段，其中来自B/Victoria/2/87样毒株和B/Yamagata/16/88样毒株的区段的 比例是1:7、2:6、4:4、5:3、6:2或7:1。7:1、6:2、4:4、3:4或1:7的比例(特别是4:4的比例）是 优选的，因为运类重配乙型流感病毒在培养宿主中生长得特别好。该B/Victoria/2/87样毒 株可W是8/化136日11日/60/08。该8/￥日1]1日旨日1日/16/88样毒株可^是8/化]1日1]1日/45/90。在运些 实施方式中，该重配乙型流感病毒通常不包含所有来自相同乙型流感供体毒株的主链区 段。
[0088] 该重配乙型流感病毒可包含：
[0089] a)SEQ ID N0:71 的PA区段、SEQ ID N0:72的PBl区段、SEQ ID N0:73的PB2区段、 SEQ ID N0:74的NP区段、SEQ ID N0:76的NS区段和沈Q ID N0:75的M区段;或
[0090] b)SEQ ID N0:71 的PA区段、SEQ ID N0:78的PB 1 区段、SEQ ID N0:73的PB2区段、 SEQ ID N0:74的NP区段、SEQ ID N0:82的NS区段和沈Q ID N0:81的M区段;或
[0091] c)SEQ ID N0:71 的PA区段、SEQ ID N0:78的PBl区段、SEQ ID N0:79的PB2区段、 SEQ ID N0:74的NP区段、SEQ ID N0:76的NS区段和沈Q ID N0:75的M区段;或
[0092] d)SEQ ID N0:30的PA区段、SEQ ID N0:72的PB 1 区段、SEQ ID N0:73的PB2区段、 SEQ ID N0:74的NP区段、SEQ ID N0:76的NS区段和沈Q ID N0:75的M区段;或
[0093] e)SEQ ID N0:71 的PA区段、SEQ ID N0:72的PBl区段、SEQ ID N0:73的PB2区段、 沈Q ID N0:74的NP区段、SEQ ID N0:82的NS区段和沈Q ID N0:81的M区段。
[0094] 乙型流感病毒目前不显示不同的HA亚型，但乙型流感病毒毒株属于两种不同的谱 系。运些谱系出现于1980年代晚期，并且具有在抗原/遗传上可彼此区分的HA[10]。当前的 乙型流感病毒毒株是B/Victo;ria/2/87样或B/Yamagata/16/88样。通常可从抗原性区分运 些毒株，但氨基酸序列的差异也可W区分运两种谱系，例如B/山行/16/88样毒株常常(但并 非总是）具有氨基酸残基164缺失（相对"Lee40"HA序列进行编号）的HA蛋白[11]。在一些实 施方式中，本发明的重配乙型流感病毒包含所有来自B/Victoria/2/87样毒株的病毒区段。 它们可包含来自B/Yamagata/16/88样毒株的病毒区段。或者，它们可包含来自B/Victoria/ 2/87样毒株和B/Yamaga化/16/88样毒株的病毒区段。
[00M]当该重配乙型流感病毒包含来自两种或更多种乙型流感病毒毒株的病毒区段时， 运些病毒区段可来自具有相关神经氨酸酶的病毒毒株。例如，提供病毒区段的流感毒株可 W都具有B/Victoria/2/87样神经氨酸酶[12]或可都具有B/Yamagata/16/88样神经氨酸 酶。例如，两种B/Victoria/2/87样神经氨酸酶可都具有一种或多种W下序列特性：（1)在残 基27处不是丝氨酸，但优选亮氨酸；（2)在残基44处不是谷氨酸，但优选赖氨酸；（3)在残基 46处不是苏氨酸，但优选异亮氨酸；（4)在残基51处不是脯氨酸，但优选丝氨酸；（5)在残基 65处不是精氨酸，但优选组氨酸；（6)在残基70处不是甘氨酸，但优选谷氨酸；（7)在残基73 处不是亮氨酸，但优选苯丙氨酸;和/或(8)在残基88处不是脯氨酸，但优选谷氨酷胺。类似 地，在一些实施方式中，神经氨酸酶可在残基43处有缺失，或可W是苏氨酸；在残基43处有 缺失，由NA基因中的S核巧缺失引起，其已被报道为B/Victoria/2/87样毒株特征，但近来 的毒株重新获得了化r-43[ 12]。相反地，当然，两种B/Yamagata/16/88样神经氨酸酶也可具 有相反性质，例如527、644^46、？51、365、670、1^73和/或?88。运些氨基酸相对于"1^6640"神 经氨酸酶序列进行编号[13]。该重配乙型流感病毒可包含具有上述特性的NA区段。或者，或 此外，该重配乙型流感病毒可包含来自特定流感毒株的病毒区段(不是NA),该流感毒株包 含具有上述特性的NA区段。
[0096] 是B/Victoria/2/87样毒株的乙型流感病毒的主链病毒区段与来自B/Victoria/ 2/87的相应病毒区段的相同性水平高于其与B/Yamagata/16/88的相应病毒区段的相同性 水平，且反之亦然。例如，B/Panama/45/90 (其是B Aamagata/16/88样毒株）的NP区段与B/ Yamagata/16/88的NP区段具有99%相同性而与B/Victoria/2/87的NP区段仅具有96%相同 性。
[0097] 当本发明的重配乙型流感病毒包含来自B/Victoria/2/87样毒株的主链病毒区段 时，该病毒区段可编码具有W下序列的蛋白质。PA蛋白可与SEQ ID N0:83的序列至少97% 相同、至少98%相同、至少99%相同或100%相同。PBl蛋白可与SEQ ID N0:84的序列至少 97%相同、至少98%相同、至少99%相同或100%相同。PB2蛋白可与SEQ ID N0:85的序列具 有至少97%相同性、至少98%相同性、至少99%相同性或100%相同性。NP蛋白可与SEQ ID N0:86的序列至少97%相同、至少98%相同、至少99%相同或100%相同。Mi蛋白可与沈Q ID N0:87的序列至少97%相同、至少98%相同、至少99%相同或100%相同。M2蛋白可与沈Q ID NO:88的序列至少97%相同、至少98%相同、至少99%相同或100%相同。NSi蛋白可与SEQ ID NO:89的序列至少97%相同、至少98%相同、至少99%相同或100%相同。NS2蛋白可与 沈Q ID N0:90的序列至少97%相同、至少98%相同、至少99%相同或100%相同。在一些实 施方式中，该重配乙型流感病毒还可包含所用运些主链区段。
[0098] 当本发明的重配乙型流感病毒包含来自B/Yamagata/16/88样毒株的主链病毒区 段时，该病毒区段可编码具有W下序列的蛋白。PA蛋白可与SEQ ID N0:91的序列至少97% 相同、至少98%相同、至少99%相同或100%相同。PBl蛋白可与SEQ ID N0:92的序列至少 97%相同、至少98%相同、至少99%相同或100%相同。PB2蛋白可与SEQ ID N0:93的序列具 有至少97%相同性、至少98%相同性、至少99%相同性或100%相同性。NP蛋白可与SEQ ID N0:94的序列至少97%相同、至少98%相同、至少99%相同或100%相同。Mi蛋白可与沈Q ID N0:95的序列至少97%相同、至少98%相同、至少99%相同或100%相同。M2蛋白可与沈Q ID NO:96的序列至少97%相同、至少98%相同、至少99%相同或100%相同。NSi蛋白可与SEQ ID NO:97的序列至少97%相同、至少98%相同、至少99%相同或100%相同。NS2蛋白可与 SEQ ID N0: