本发明属于生物显影成像、生物检测、光动力治疗、药物靶向传输领域，具体涉及一种基于稀土上转换材料的聚偶氮苯多功能复合纳米粒子的制备。
背景技术：
上转换纳米稀土发光材料（Upconversion nanoparticles UCNPs），特别是镧系元素掺杂的纳米晶体，是一种能将低能量的光子转换成高能量光子的反斯托克发光的功能材料，由于能将近红外光转换成可见光和紫外光而倍受青睐。最近发展起来的稀土上转换纳米粒子具有独特的能级结构，可以在低能量(长波长)的近红外光激发下吸收两个或多个光子，将能量上转换而发出紫外至可见区的光。研究表明，近红外激光(700~1100 nm)可以很好地穿透人体组织而不被吸收，且无额外伤害。
近半个世纪以来，肿瘤已成为严重威胁人类健康的常见病，难以治疗。其临床的主要问题是：肿瘤的诊断与治疗分离，在治疗的同时很难对其进行跟踪，集诊断与治疗于一体的诊疗剂的开发是科技工作者们一直研究的热点。基于其自身的穿透能力和发光优势，上转换纳米粒子可以作为优异的诊断基元，而治疗部分通常采用智能响应载体来达到可控释放治疗的目的。利用光响应基元复合稀土纳米粒子作为诊疗剂的研究可以实现体外定时操控，达到适合治疗的药物控制释放速度成为研究热点。目前，有研究通过稀土纳米粒子表面修饰介孔二氧化硅，光响应基元接枝在二氧化硅中来完成。然而，这种介孔通道对药物的负载难免会使负载量受到限制，Jianan Liu, Wenbo Bu, Limin Pan, and Jianlin Shi. NIR-triggered anticancer drug delivery by upconverting nanoparticles with integrated azobenzene-modified mesoporous. Angew. Chem. Int. Ed. 2013, 52, 1-6;Yanmei Yang, Bhaarathy Velmurugan, Xiaogang Liu, and Bengang Xing, NIR photoresponsive crosslinked upconverting nanocarriers toward selective intracellular drug release. Small 2013, 9, 2937–2944;Chi Yao, Peiyuan Wang, Xiaomin Li, Xiaoyu Hu, JunliHou, Leyong Wang, and Fan Zhang, Near-infrared-triggered azobenzene-liposome/upconversion nanoparticle hybrid vesicles for remotely controlled drug delivery to overcome cancer multidrug resistance.Adv. Mater. 2016, 28, 9341–9348.如何开发一种基于上转换纳米粒子又同时具有一定中空结构类似蛋黄结构的具有光响应的多功能诊疗剂是急需解决的问题。
技术实现要素：
本发明的目的是解决临床的主要问题：肿瘤的诊断与治疗分离，在治疗的同时很难对其进行跟踪。利用稀土纳米粒子对近红外激光的上转换效应，产生的紫外光、可见光能使微球外壳偶氮苯基元在“光开关”作用下控制释放药物，并为解决载体的刺激响应性局限于紫外区的难题提供新的思路和途径。从而提供了一种基于稀土上转换材料的聚偶氮苯多功能复合纳米粒子的制备方法。
一种基于稀土上转换材料的聚偶氮苯多功能纳米粒子的制备方法,该复合纳米粒子内核为同质核壳的稀土氟化物纳米粒子，其化学式为：NaYF4:0.5%Yb3+, 30%Tm3+ / NaYF4纳米粒子，外核为以偶氮苯为交联剂的聚甲基丙烯酸壳层,其具体步骤为：
1)制备NaYF4: 0.5%Yb3+, 30%Tm3+ / NaYF4核/壳上转换纳米粒子：a)在四口烧瓶中加入1-十八烯和油酸，之后分别加入氯化钇水溶液、氯化镱水溶液和氯化铥水溶液，将混合溶液在氮气气氛下缓慢升温至120 ℃ ~ 150 ℃，以除去反应体系中的水分和氧气，随后继续升温至150 ℃ ~ 200 ℃保温50 min ~ 60 min后移除加热套，自然冷却至室温后，将氢氧化钠甲醇溶液和氟化铵甲醇溶液混合均匀后快速加入四口烧瓶中搅拌1 h ~ 2 h；缓慢升温至100 ℃ ~ 150 ℃除掉甲醇和水分，随后快速升温至260 ℃ ~ 300 ℃保温60 min ~ 90 min；冷却至室温后，向反应烧瓶中加入乙醇沉淀产物，离心并用乙醇洗涤后，离心速率为5000 ~ 10000 转/分钟，离心时间为10 min ~ 20 min，产物分散于氯仿中待用；b)对产物进行同质惰性壳层包覆：在四口烧瓶中加入1-十八烯、油酸和YCl3水溶液，将混合溶液在氮气气氛下缓慢升温至120 ℃ ~150 ℃，除去反应体系中的水分和氧气，后升温到150 ℃ ~ 200 ℃保温50 min ~ 60 min；移除电热套，让反应溶液自然冷却至室温；加入步骤a分散在氯仿中的NaYF4: 0.5%Yb3+/30%Tm3+
/ NaYF4上转换纳米粒子并搅拌1h~2h，缓慢升温至80℃~100℃，除去氯仿，然后降至室温；将氢氧化钠甲醇溶液和氟化铵甲醇溶液混合均匀后快速加入到四口烧瓶中并搅拌，缓慢升温至100℃~150℃除掉甲醇和水分，随后快速升温至260℃~300℃，并保温60 min~90 min；冷却至室温后，向反应烧瓶中加入乙醇沉淀产物，离心后用乙醇洗涤产物，速率为5000~10000 转/分钟，离心时间为10 min~20 min产物分散于环己烷中待用。
2)制备二氧化硅包覆纳米核壳微粒SiO2@ NaYF4 / NaYF4：在三口烧瓶中加入表面活性剂CO-520、环己烷和步骤b的上转换纳米粒子环己烷溶液，搅拌5 min~10 min后加入氨水（30 wt. %），密封超声20 min~30 min；加入正硅酸乙酯后搅拌20h~30h，转速为500~800转/分钟；继续加入MPS硅烷偶联剂搅拌20h~30h，反应完成后，加入丙酮破乳，离心分离产物（UCNPs@SiO2），用乙醇溶液洗涤2~4次，最后产物分散在乙醇中待用。
3）制备4,4′-二甲基丙烯酰胺偶氮苯（BMAAB）：首先合成4,4′-二硝基偶氮苯：将对硝基苯胺溶于浓硫酸和去离子水的混合液中，边搅拌边加入过硫酸铵，反应1 h ~ 2 h后冷却至室温，过滤得到黄棕色沉淀物，洗涤沉淀物至中性，40 ℃ ~ 60 ℃真空烘干；其次，合成4,4′-二氨基偶氮苯：将4,4′-二硝基偶氮苯溶于乙醇和去离子水的混合液中，边搅拌边缓慢加入硫化钠，升温至80 ℃ ~ 100 ℃后回流，回流反应时间为20 min ~ 40 min，冷却至室温后过滤，将沉淀物在乙醇中重结晶后，40 ℃ ~ 60 ℃真空烘干得到产物；最后，4,4′-二甲基丙烯酰胺偶氮苯（BMAAB）的合成：将4,4′-二氨基偶氮苯溶于氯仿中，加入甲基丙烯酸和EDC•HCl，在N2保护下搅拌，反应停止后，水洗反应溶液，取下层有机溶液，旋蒸除去氯仿溶剂后得到粗产物，将粗产物在乙醇中重结晶，40 ℃ ~ 60 ℃真空干燥后得到产物；
4）制备稀土上转换发光材料/聚偶氮苯复合纳米粒子：将乙烯化UCNPs @ SiO2微球超声20 min~30 min分散在乙腈中，然后加入BMAAB交联剂、PAA pH响应性单体、DVB助交联剂和AIBN引发剂（单体总量的3 wt.%），装上油水分离器、回流冷凝管，氮气置换3~4次以除掉反应容器中的空气，接上氮气包，升温至80℃~100℃后保15min~20 min，继续升温至100℃~120℃，在3h~4h内（包括加热升温时间）将反应溶剂蒸出一半后停止反应，并向反应溶液中加入阻聚剂对二苯酚，待溶液冷却至室温后过滤得到产物，乙醇洗涤至离心上层清液为无色，将核壳结构微球分散在无水乙醇中，加入氢氟酸，搅拌20h~30h后离心，洗涤上层离心清液至无色，30℃~60℃真空干燥得到的产物。
优选地，如上所述的一种基于稀土上转换材料的聚偶氮苯多功能纳米粒子的制备方法,所述步骤（1）的a）步骤中1-十八烯和油酸的加入量分别为10 mL ~ 20 mL，5 mL ~ 10 mL，氯化钇水溶液(0.2 mol/ mL)、氯化镱水溶液(0.2 mol/ mL)和氯化铥水溶液(0.1 mol/ mL)的加入量为1 mL ~ 5 mL，0.5 mL ~ 4 mL，10 µL ~ 30µL，氢氧化钠甲醇溶液（0.5mol/ mL）和氟化铵甲醇（0.5mol/ mL）的用量为3 mL ~ 6 mL，5 mL ~ 10 mL，乙醇沉淀产物的用量为5 mL ~ 20 mL，氯仿的用量为5 mL~ 20mL。
优选地，如上所述的一种基于稀土上转换材料的聚偶氮苯多功能纳米粒子的制备方法,所述步骤（1）b步骤的1-十八烯和油酸的加入量分别为10 mL ~ 20 mL，5 mL ~ 10 mL，氯化钇水溶液(0.2 mol/ mL)加入量为3 mL ~ 6 mL，氢氧化钠甲醇溶液（0.5mol/ mL）和氟化铵甲醇（0.5mol/ mL）的用量为3 mL ~ 6 mL，5 mL ~ 10 mL，乙醇沉淀产物的用量为5mL~ 20mL，环己烷的用量为5 mL~ 20mL。
优选地，如上所述的一种基于稀土上转换材料的聚偶氮苯多功能纳米粒子的制备方法,所述步骤(1)中，NaYF4: 0.5%Yb3+, 30%Tm3+ / NaYF4核/壳上转换纳米粒子的内核尺寸为30 nm~50 nm，外壳厚度为50 nm~80 nm。
优选地，如上所述的一种基于稀土上转换材料的聚偶氮苯多功能纳米粒子的制备方法,所述步骤(2)中，表面活性剂CO-520、环己烷和上转换纳米粒子环己烷溶液加入量分别为1 mL ~ 3 mL，10 mL ~ 15 mL，5 mL ~ 10 mL，氨水（30 wt. %）加入量为0.1 mL ~ 0.3 mL，正硅酸乙酯用量为0.1 mL ~ 0.2 mL，MPS硅烷偶联剂用量为1 mL ~ 3 mL。
优选地，如上所述的一种基于稀土上转换材料的聚偶氮苯多功能纳米粒子的制备方法,所述步骤(3)中，对硝基苯胺的加入量为5 g ~ 15 g，浓硫酸和去离子水的混合体积比为1:3，过硫酸铵的加入量为10 g ~ 40 g；4,4′-二硝基偶氮苯用量为3g ~ 10 g，乙醇和去离子水的混合体积比为1:4，硫化钠加入量为10 g ~ 40 g；4,4′-二氨基偶氮苯加入量为1 g ~ 5 g，氯仿用量为500mL ~ 1000mL，甲基丙烯酸和EDC•HCl的用量为5 mL ~ 15 mL，1g ~ 5g。
优选地，如上所述的一种基于稀土上转换材料的聚偶氮苯多功能纳米粒子的制备方法，所述步骤(4)中，乙烯化UCNPs @ SiO2微球分散在乙腈中的体积比为1:2，BMAAB交联剂、PAA pH响应性单体、DVB助交联剂和AIBN引发剂的用量分别为20 mg ~ 40 mg，80 mg ~ 100 mg，30 µL ~ 50 µL，1 mg ~ 5 mg；阻聚剂、无水乙醇、氢氟酸的用量分别为1g ~ 2 g，1 mL ~ 5 mL，3 mL ~ 6 mL。
现有技术相比，本发明的有益效果：
（1）偶氮苯微球具有优异的紫外光响应性，然而短波长紫外光渗透性差以及对生物体的伤害限制了其应用。本项目巧妙利用稀土上转换材料吸收近红外光发出紫外和可见光的特点，使复合粒子具有NIR光触发的载药释放行为；而发出的可见光用于荧光成像。
（2）将稀土上转换材料与光响应的偶氮苯材料通过二氧化硅“中介体”复合，继而刻蚀“中介体”形成多功能复合中空纳米粒子，既实现了稀土粒子与偶氮苯载体的复合，刻蚀后的中空结构也保证了高效的载药率,可进一步与肿瘤细胞结合。
（3）合成该复合纳米粒子前先采用反相微乳液法，在疏水性的UCNPs的表面包覆一层二氧化硅壳层，并用MPS硅烷偶联剂对其进行功能化修饰，使粒子表面带有碳碳双键，为后续的聚合反应做准备。
附图说明
图1为合成BMAAB的红外光谱。
图2为实施例1稀土上转换发光材料/聚偶氮苯复合中空微球的合成刻蚀前的TEM结果图。
图3为实施例2稀土上转换发光材料/聚偶氮苯复合中空微球的合成刻蚀前的TEM结果图。
图4为实施例3稀土上转换发光材料/聚偶氮苯复合中空微球的合成刻蚀前的TEM结果图。
图5为稀土上转换发光材料/聚偶氮苯复合中空微球的合成刻蚀后的TEM结果图。
具体实施方式
为能清楚说明本发明方案的技术特点，下面结合具体实施例，对本发明进行阐述。但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。
实施例1
（1）制备NaYF4: 0.5%Yb3+, 30%Tm3+ / NaYF4核/壳上转换纳米粒子：a)：在100 ml四口烧瓶中加入1-十八烯15 ml和油酸7 ml，之后分别加入3.975 ml氯化钇水溶液(0.2mol/L)1 ml氯化镱水溶液(0.2mol/L)和25 µL氯化铥水溶液(0.1mol/L)，将混合溶液在氮气气氛下缓慢升温至120 ℃，以除去反应体系中的水分和氧气，随后继续升温至150 ℃保温50 min后移除加热套，自然冷却至室温后，将5 ml氢氧化钠甲醇溶液(0.5mol/L)和8 ml氟化铵甲醇溶液(0.5mol/L)混合均匀后快速加入四口烧瓶中，随后将反应溶液在室温下搅拌1 h；缓慢升温至100 ℃除掉甲醇和水分，随后快速升温至260 ℃并保温60 min；冷却至室温后，向反应烧瓶中加入10 ml乙醇沉淀产物， 随后将混合溶液以8000 转/分钟离心15 min，并用乙醇洗涤2次，产物分散于10 ml氯仿中待用；b)：对产物进行同质惰性壳层包覆：在100 ml四口烧瓶中加入1-十八烯15 ml、7 ml油酸和5 mlYCl3水溶液(0.2mol/L)，将混合溶液在氮气气氛下缓慢升温至120 ℃，除去反应体系中的水分和氧气，后升温到150 ℃保温50 min后移除电热套，让反应溶液自然冷却至室温；加入分散在氯仿中的NaYF4: 20%Yb3+/0.5%Tm3+上转换纳米粒子并搅拌1小时后，缓慢升温至85 ℃，除去氯仿，然后降至室温；将5 ml氢氧化钠甲醇溶液(0.5mol/L)和8 ml氟化铵甲醇溶液(0.5mol/L)混合均匀后快速加入到四口烧瓶中并搅拌1 h，缓慢升温至100 ℃除掉甲醇和水分，随后快速升温至280 ℃，并保温80 min；冷却至室温后，向反应烧瓶中加入10 ml乙醇沉淀产物，随后将混合溶液以8000 转/分钟离心10 min，用乙醇洗涤产物2次，产物于10 ml环己烷中待用。
（2）制备二氧化硅包覆纳米核壳微粒SiO2@ NaYF4 / NaYF4：在100 ml三口烧瓶中加入2 ml表面活性剂CO-520、12 ml环己烷和8 ml上转换纳米粒子环己烷溶液，搅拌10 min后加入0.16 ml氨水（wt30%），密封超声30 min；加入0.12 ml正硅酸乙酯，室温下搅拌24 h；继续加入MPS硅烷偶联剂2 ml，继续搅拌24 h；反应完成后，加入丙酮破乳，离心(离心转速500转/分钟)分离产物（UCNPs@SiO2），用乙醇溶液洗涤3次，最终产物分散在乙醇中待用。
（3）制备4,4′-二甲基丙烯酰胺偶氮苯（BMAAB）：首先，合成4,4′-二硝基偶氮苯：将10 g对硝基苯胺溶于25 ml浓硫酸和125 ml去离子水的混合液中，边搅拌边加入35 g过硫酸铵，在42 ℃下反应2 h后冷却至室温，过滤得到黄棕色沉淀物，将沉淀用去离子水洗涤至滤液呈中性，真空干燥箱中60 ℃烘干。其次，合成4,4′-二氨基偶氮苯：将5 g 4,4′-二硝基偶氮苯溶于45 ml乙醇和10 ml去离子水的混合液中，边搅拌边缓慢加入30 g硫化钠，升温至80 ℃后回流30 min，反应停止后，冷却至室温后，过滤得沉淀物，将沉淀在乙醇中重结晶后，置于真空干燥箱中50 ℃烘干得到产物。最后，4,4′-二甲基丙烯酰胺偶氮苯（BMAAB）的合成：将2 g 4,4′-二氨基偶氮苯溶于900 mL氯仿中，加入10 mL甲基丙烯酸和3.6 g EDC•HCl，在N2保护下搅拌48 h，反应停止后，将反应溶液水洗一次，取下层有机溶液，旋蒸除去氯仿溶剂后得到粗产物，将粗产物在乙醇中重结晶得到最终的产物，置于真空干燥箱中50 ℃烘干至恒重。
（4）将30 mg乙烯化UCNPs @ SiO2微球超声30 min分散在50 mL乙腈，然后依此加入30 mg BMAAB交联剂、100 mg PAA pH响应性单体、50 µL DVB助交联剂和3 mg AIBN引发剂（单体总量wt30%）；装上油水分离器、回流冷凝管，氮气置换4次除掉反应容器中的空气，接上氮气包。在30 min内将温度由室温升至80 ℃，保温15 min后升温至100 ℃。在3.5 h内（包括加热升温时间）将反应溶剂蒸出一半后停止反应，并向反应溶液中加入少量阻聚剂（对二苯酚）。待溶液冷却至室温后过滤得到产物，乙醇洗涤至离心上层清液为无色。将核壳结构微球分散在2 mL无水乙醇中，再加入5 mL氢氟酸，搅拌24 h后离心，用无水乙醇至上层离心清液为无色，将得到的产物置于50 ℃真空干燥箱烘干至恒重。
实施例2
（1）制备NaYF4: 0.5%Yb3+, 30%Tm3+ / NaYF4核/壳上转换纳米粒子：a)：在100 ml四口烧瓶中加入1-十八烯10ml和油酸5 ml，之后分别加入1 ml氯化钇水溶液(0.2mol/L)、0.5 ml氯化镱水溶液(0.2mol/L)和10 µL氯化铥水溶液(0.1mol/L)，将混合溶液在氮气气氛下缓慢升温至150 ℃，以除去反应体系中的水分和氧气，随后继续升温至200 ℃保温60 min后移除加热套，自然冷却至室温后，将3 ml氢氧化钠甲醇溶液(0.5mol/L)和5 ml氟化铵甲醇溶液(0.5mol/L)混合均匀后快速加入四口烧瓶中，随后将反应溶液在室温下搅拌1 h；缓慢升温至150 ℃除掉甲醇和水分，随后快速升温至300 ℃并保温90 min；冷却至室温后，向反应烧瓶中加入5 ml乙醇沉淀产物，随后将混合溶液以10000 转/分钟离心20 min，并用乙醇洗涤2次，产物分散于5 ml氯仿中待用；b)：对产物进行同质惰性壳层包覆：在100 ml四口烧瓶中加入1-十八烯10 ml、5 ml油酸和3 mlYCl3水溶液(0.2mol/L)，将混合溶液在氮气气氛下缓慢升温至150 ℃，除去反应体系中的水分和氧气，后升温到200 ℃保温60 min后移除电热套，让反应溶液自然冷却至室温；加入分散在氯仿中的NaYF4: 20%Yb3+/0.5%Tm3+上转换纳米粒子并搅拌半小时后，缓慢升温至80 ℃，除去氯仿，然后降至室温；将3 ml氢氧化钠甲醇溶液(0.5mol/L)和5 ml氟化铵甲醇溶液(0.5mol/L)混合均匀后快速加入到四口烧瓶中并搅拌1 h，缓慢升温至120 ℃除掉甲醇和水分，随后快速升温至260 ℃，并保温60 min；冷却至室温后，向反应烧瓶中加入5 ml乙醇沉淀产物，随后将混合溶液以10000转/分钟离心20min，用乙醇洗涤产物2次，产物于5 ml环己烷中待用。
（2）制备二氧化硅包覆纳米核壳微粒SiO2@ NaYF4 / NaYF4：在100 ml三口烧瓶中加入1 ml表面活性剂CO-520、10ml环己烷和5 ml上转换纳米粒子环己烷溶液，搅拌8 min后加入0.1 ml氨水（wt30 %），密封超声20 min；加入0.1 ml正硅酸乙酯，室温下搅拌20 h；继续加入MPS 1 ml硅烷偶联剂，继续搅拌20 h；反应完成后，加入丙酮破乳，离心（转速800转/分钟）分离产物（UCNPs@SiO2），用乙醇溶液洗涤3次，最终产物分散在乙醇中待用。
（3）制备4,4′-二甲基丙烯酰胺偶氮苯（BMAAB）：首先，合成4,4′-二硝基偶氮苯：将5 g对硝基苯胺溶于10 ml浓硫酸和30 ml去离子水的混合液中，边搅拌边加入10 g过硫酸铵，在42 ℃下反应2 h后冷却至室温，过滤得到黄棕色沉淀物，将沉淀用去离子水洗涤至滤液呈中性，真空干燥箱中60 ℃烘干。其次，合成4,4′-二氨基偶氮苯：将3 g 4,4′-二硝基偶氮苯溶于32 ml乙醇和8 ml去离子水的混合液中，边搅拌边缓慢加入10 g硫化钠，升温至100 ℃后回流40 min，反应停止后，冷却至室温后，过滤得沉淀物，将沉淀在乙醇中重结晶后，置于真空干燥箱中50 ℃烘干得到产物。最后，4,4′-二甲基丙烯酰胺偶氮苯（BMAAB）的合成：将1 g 4,4′-二氨基偶氮苯溶于900 mL氯仿中，加入5 mL甲基丙烯酸和1 g EDC•HCl，在N2保护下搅拌48 h，反应停止后，将反应溶液水洗一次，取下层有机溶液，旋蒸除去氯仿溶剂后得到粗产物，将粗产物在乙醇中重结晶得到最终的产物，置于真空干燥箱中50℃烘干至恒重。
（4）将30 mg乙烯化UCNPs @ SiO2微球超声30 min分散在50 mL乙腈，然后依此加入40 mg BMAAB交联剂、150 mg PAA pH响应性单体、50 µL DVB助交联剂和3 mg AIBN引发剂（单体总量的3 wt.%）。装上油水分离器、回流冷凝管，氮气置换5次除掉反应容器中的空气，接上氮气包。在30 min内将温度由室温升至100 ℃，保温20 min后升温至120 ℃。在3.5 h内（包括加热升温时间）将反应溶剂蒸出一半后停止反应，并向反应溶液中加入少量阻聚剂（对二苯酚）。待溶液冷却至室温后过滤得到产物，乙醇洗涤至离心上层清液为无色。将核壳结构微球分散在1 mL无水乙醇中，再加入3 mL氢氟酸，搅拌30 h后离心，用无水乙醇至上层离心清液为无色，将得到的产物置于50 ℃真空干燥箱烘干至恒重。
实施例3
（1）制备NaYF4: 0.5%Yb3+, 30%Tm3+ / NaYF4核/壳上转换纳米粒子：a)：在100 ml四口烧瓶中加入1-十八烯20 ml和油酸10 ml，之后分别加入5 ml氯化钇水溶液(0.2mol/L)、4 ml氯化镱水溶液(0.2mol/L)和30 µL氯化铥水溶液(0.1mol/L)，将混合溶液在氮气气氛下缓慢升温至130 ℃，以除去反应体系中的水分和氧气，随后继续升温至170 ℃保温55 min后移除加热套，自然冷却至室温后，将6 ml氢氧化钠甲醇溶液(0.5mol/L)和10 ml氟化铵甲醇溶液(0.5mol/L)混合均匀后快速加入四口烧瓶中，随后将反应溶液在室温下搅拌1 h；缓慢升温至130 ℃除掉甲醇和水分，随后快速升温至280 ℃并保温75 min；冷却至室温后，向反应烧瓶中加入20 ml乙醇沉淀产物，随后将混合溶液以8000 转/分钟离心15 min，并用乙醇洗涤2次，产物分散于20 ml氯仿中待用；b)：对产物进行同质惰性壳层包覆：在100 ml四口烧瓶中加入1-十八烯20 ml、10 ml油酸和6 mlYCl3水溶液(0.2mol/L)，将混合溶液在氮气气氛下缓慢升温至130 ℃，除去反应体系中的水分和氧气，后升温到170 ℃保温55 min后移除电热套，让反应溶液自然冷却至室温；加入分散在氯仿中的NaYF4: 20%Yb3+/0.5%Tm3+上转换纳米粒子并搅拌半小时后，缓慢升温至100 ℃，除去氯仿，然后降至室温；将6 ml氢氧化钠甲醇溶液(0.5mol/L)和10 ml氟化铵甲醇溶液(0.5mol/L)混合均匀后快速加入到四口烧瓶中并搅拌1 h，缓慢升温至130 ℃除掉甲醇和水分，随后快速升温至280 ℃，并保温75 min；冷却至室温后，向反应烧瓶中加入20 ml乙醇沉淀产物，随后将混合溶液以8000 转/分钟离心10 min，用乙醇洗涤产物2次，产物于20 ml环己烷中待用。
（2）制备二氧化硅包覆纳米核壳微粒SiO2@ NaYF4 / NaYF4：在100 ml三口烧瓶中加入3 ml表面活性剂CO-520、15 ml环己烷和10 ml上转换纳米粒子环己烷溶液，搅拌8 min后加入0.3 ml氨水（wt 30 %），密封超声30 min；加入0.2 ml正硅酸乙酯，室温下搅拌25 h；继续加入MPS 3 ml硅烷偶联剂，继续搅拌25 h；反应完成后，加入丙酮破乳，离心分离产物（UCNPs@SiO2），用乙醇溶液洗涤3次，最终产物分散在乙醇中待用。
（3）制备4,4′-二甲基丙烯酰胺偶氮苯（BMAAB）：首先，合成4,4′-二硝基偶氮苯：将15 g对硝基苯胺溶于45 ml浓硫酸和135 ml去离子水的混合液中，边搅拌边加入40 g过硫酸铵，在42 ℃下反应2 h后冷却至室温，过滤得到黄棕色沉淀物，将沉淀用去离子水洗涤至滤液呈中性，真空干燥箱中50 ℃烘干。其次，合成4,4′-二氨基偶氮苯：将10 g 4,4′-二硝基偶氮苯溶于50 ml乙醇和12.5 ml去离子水的混合液中，边搅拌边缓慢加入40 g硫化钠，升温至90 ℃后回流30 min，反应停止后，冷却至室温后，过滤得沉淀物，将沉淀在乙醇中重结晶后，置于真空干燥箱中50 ℃烘干得到产物。最后，4,4′-二甲基丙烯酰胺偶氮苯（BMAAB）的合成：将5 g 4,4′-二氨基偶氮苯溶于900 mL氯仿中，加入15 mL甲基丙烯酸和5 g EDC•HCl，在N2保护下搅拌48 h，反应停止后，将反应溶液水洗一次，取下层有机溶液，旋蒸除去氯仿溶剂后得到粗产物，将粗产物在乙醇中重结晶得到最终的产物，置于真空干燥箱中50 ℃烘干至恒重。
（4）将30 mg乙烯化UCNPs @ SiO2微球超声30 min分散在50 mL乙腈，然后依此加入75 mg BMAAB交联剂、170 mg PAA pH响应性单体、40 µL DVB助交联剂和3 mg AIBN引发剂（单体总量的3 wt.%）。装上油水分离器、回流冷凝管，氮气置换5次除掉反应容器中的空气，接上氮气包。在30 min内将温度由室温升至90 ℃，保温15 min后升温至110 ℃。在3.5 h内（包括加热升温时间）将反应溶剂蒸出一半后停止反应，并向反应溶液中加入少量阻聚剂（对二苯酚）。待溶液冷却至室温后过滤得到产物，乙醇洗涤至离心上层清液为无色。将核壳结构微球分散在5 mL无水乙醇中，再加入6 mL氢氟酸，搅拌25 h后离心，用无水乙醇至上层离心清液为无色，将得到的产物置于50 ℃真空干燥箱烘干至恒重。