对氨基苯甲脒仿生亲和配基的仿生亲和纯化方法与流程

文档序号:14660965发布日期:2018-06-12 17:51阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种对氨基苯甲脒仿生亲和配基的仿生亲和纯化方法,包括以下步骤:

1)、合成对氨基苯甲脒仿生亲和材料

(1)、表氯醇活化琼脂糖凝胶

用双蒸水按1:10V/V的比例对琼脂糖凝胶进行彻底洗涤,直到流出的溶液的pH达到7.0,洗涤过的琼脂糖凝胶风干后再溶解在活化溶液中,在40℃摇床中100rpm震荡2.5h进行活化,得到表氯醇活化琼脂糖凝胶6B,所述活化溶液为1M的氢氧化钠、2.5g二甲基亚砜以及10ml表氯醇;

(2)、表氯醇活化琼脂糖凝胶的氨基化

将35%饱和氨添加到表氯醇活化后的琼脂糖凝胶6B中,再加入一定量双蒸水,在30℃摇床中100rpm孵化过夜,使得活化琼脂糖凝胶6B加入氨基,得到氨基化活化琼脂糖凝胶6B;

(3)、连接氰尿酰氯连接臂

将氨基化活化琼脂糖凝胶6B按等体积加入50V/V%丙酮,在冰浴搅拌的条件下以0.5ml/min的流速缓慢加入氰尿酰氯溶液,用1M的氢氧化钠溶液调节该溶液的pH值至7.0,再用50V/V%丙酮洗涤去除多余的浮游氨基基团,氰尿酰氯连接臂连接至活化琼脂糖凝胶6B上,得到连接氰尿酰氯连接臂的对氨基苯甲脒配基;

(4)、螯合对氨基苯甲脒配基

将上述步骤(3)的过饱和的连接氰尿酰氯连接臂的对氨基苯甲脒配基溶解在2M的碳酸钠溶液中,然后在碳酸钠溶液中缓慢添加琼脂糖凝胶,室温搅拌24h,用双蒸水洗涤凝胶,保存在0.02W/V%的叠氮钠,得到仿生亲和材料;

2)、仿生亲和材料的纯化

(1)洗涤并平衡对氨基苯甲脒琼脂糖凝胶柱

上样前,用5-10个柱体积的用0.22μm过滤过的双蒸水洗涤琼脂糖凝胶,然后用5-10个柱体积的100mMpH 7.4的Tris-HCl缓冲液的上样缓冲液平衡柱子,流速不大于3ml/min,柱子压力不超过0.3mPa,所述上样缓冲液为100mM pH 7.4的Tris-HCl缓冲液;

(2)洗涤去除杂蛋白

取10mg/ml金属蛋白酶MP粗品1ml,上样至按2)、(1)中平衡过的苯甲脒琼脂糖凝胶预装柱,上样时流速不大于1ml/min,用洗脱缓冲液1洗涤5-10个柱体积,去除杂蛋白,流速不大于3ml/min,柱子压力不超过0.3mPa,所述洗脱缓冲液1为100mM的NaCl的100mM pH 7.4的Tris-HCl缓冲液;

(3)获得蛋白酶MP纯蛋白

按照步骤2)、(2)去除杂蛋白之后,用洗涤缓冲液2洗脱,收取活性峰,为金属蛋白酶MP的纯酶,流速不大于3ml/min,柱子压力不超过0.3mPa,所述洗涤缓冲液2为500mM的NaCl的100mM pH7.4的Tris-HCl缓冲液;

(4)洗涤并保存柱子

在获得蛋白酶纯酶之后,用洗涤缓冲液3洗涤柱子,去除牢固结合在柱子上的蛋白,再用0.22μm过滤过的双蒸水冲洗5-10个柱体积,去除洗涤缓冲液中的各种盐离子,再用20%乙醇保存柱子,所述洗涤缓冲液3为2M的NaCl的100mM pH 7.4的Tris-HCl缓冲液;

经上述步骤后,蛋白酶活性回收率为35.7%,蛋白纯度为98.7%。

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