一种肝细胞癌患者外周血GPC3检测方法与流程

技术特征：

1.一种肝细胞癌患者外周血GPC3检测方法，其特征在于，检测方法步骤如下：利用膜过滤装置分离获取无法获得组织标本的肝癌患者外周血中的CTC；运用细胞蜡块技术制作薄层切片；进而检测GPC3表达情况；

所述的利用膜过滤装置分离获取无法获得组织标本的肝癌患者外周血中的CTC，其方法步骤如下：

1)采集晚期肝癌患者外周血：肘正中静脉5ml；

2)外周血样预处理：将采集的外周血样10倍稀释，稀释液成分：1mmol/l EDTA+0.1％BSA,稀释后加多聚甲醛固定外周血样10分钟，固定终浓度为0.25％；

3)利用膜过滤分离肿瘤细胞装置过滤外周血样，分离获得外周血循环肿瘤细胞：将预处理的外周血样加入到膜过滤分离肿瘤细胞装置的血样容器(2)中，使其依靠重力自然过滤；

4)过滤结束后，从膜过滤分离肿瘤细胞装置中取下滤器(3)，将循环肿瘤细胞染色液加入到滤器(3)中，染色2min，PBS缓冲液冲洗干净，取下滤膜(7)，放置在载玻片上，干燥后在显微镜下观察，确定是否存在CTC；

所述的运用细胞蜡块技术制作薄层切片，其方法步骤如下：

1)脱色：从载玻片上取下带有CTC的滤膜(7)，置于脱色液中浸泡4-6小时，脱去CTC染色液，所述脱色液为：95％酒精与100％二甲苯按容积比1:1混匀；

2)包裹：浸泡结束后取出滤膜(7)，用吸水纸包裹；

3)固定：将包裹物置于10％中性福尔马林中，固定4-6h；

4)浸蜡包埋：固定结束后取出包裹物，脱水后置于石蜡包埋盒中，浸蜡包埋制作细胞石蜡块；

5)薄层切片：用切片机将细胞石蜡块连续切片，制成厚度为4μm的薄层切片；

所述的检测GPC3表达情况，方法步骤如下：

1)烤片：将CTC蜡块薄层切片在60℃恒温箱中烤片2小时；

2)脱蜡：切片于两瓶二甲苯中分别放置5分钟；

3)水化：将切片依次在无水乙醇、95％乙醇、85％乙醇中分别放置1分钟，自来水、蒸馏水冲洗；

4)抗原修复：将高压锅内的修复液EDTA煮沸，放入切片至完全没入修复液盖上高压锅盖及压力阀，加热至高压锅喷气后1.5分钟，离火，将高压锅稍冷却打开锅盖，切片在修复液中自然冷却；

5)蒸馏水冲洗；

6)去除内源性过氧化物酶：用3％H2O2作用切片10分钟；

7)蒸馏水冲洗；

8)PBS浸洗5次各1.5分钟；

9)滴加GPC3一抗；

10)4℃冰箱中过夜；

11)PBS浸洗5次各1.5分钟；

12)滴加通用型IgG抗体-HRP多聚体；

13)37℃水浴锅中孵育20分钟；

14)PBS浸洗5次各1.5分钟；

15)显微镜下控制，DAB显色；

16)自来水冲洗，苏木精染液复染2分钟，盐酸酒精分化，氨水返蓝；

17)自来水冲洗5分钟；

18)50％、70％、85％、95％、100％梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性快干胶封片；

19)细胞病理学专家阅片，判读GPC3表达情况。

2.根据权利要求1所述的肝细胞癌患者外周血GPC3检测方法，其特征在于，所述的膜过滤装置包括滤器(3)、血样容器(2)、废液缸(5)和铁架台(1)，所述铁架台(1)设有底座(11)、立架(12)和支架(13)，所述血样容器(2)通过支架(13)设置于铁架台(1)上部，血样容器(2)的下方为滤器(3)，滤器(3)通过输液器(4)联通至废液缸(5)，废液缸(5)设置于底座(11)上。

3.根据权利要求2所述的肝细胞癌患者外周血GPC3检测方法，其特征在于：所述滤器(3)包括滤器上口(6)、滤膜(7)、载滤膜平台(8)和滤器下口(9)，滤膜(7)置于载滤膜平台（ 8） 上；滤器上口(6)接血样容器(2)，滤器下口(9)通过输液器(4)接废液缸(5)。

4.根据权利要求3所述的肝细胞癌患者外周血GPC3检测方法，其特征在于：所述滤膜(7)为疏水材料制成，其上均匀布满口径为10微米的滤孔(10)。