TuVIPP1蛋白及其编码基因与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种TuVIPPI蛋白及其编码基因与应用。
【背景技术】
[0002] VIPP(vesicle-induceingproteininplastids，质体囊泡诱导生成蛋白）是一 种叶绿体定位蛋白，据报道在衣藻和拟南芥叶绿体内膜、基质和内囊体膜上均有分布，vipp 基因缺失突变体存在内囊体结构严重缺陷，不能光合自养等表型。在主要农作物中，VIPP基 因的功能还未见研究报道。
[0003] 近年来，利用模式植物（拟南芥）系统为手段，用来研究作物大豆、小麦等中的重 要基因的研究策略得到科学家们广泛的应用。根本原因在于作物基因组复杂，要想研究其 重要基因的功能周期长且工作难度大。因此以反向遗传和模式植物为研究策略，以分子生 物学、遗传学、细胞生物等研究技术为研究手段的实验体系应育而生。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种TuVIPPI蛋白及其编码基因。
[0005] 本发明提供的蛋白，命名为TuVIPPI蛋白，来源于小麦，是如下1)或2)的蛋白质：
[0006] 1)由序列表中序列2所示的氨基酸残基组成的蛋白质；
[0007] 2)将序列表中序列2的氨基酸序列残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代 和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由1)衍生的蛋白质。
[0008] 上述经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨 基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
[0009] 编码上述蛋白的DNA分子也是本发明保护的范围。
[0010] 上述DNA分子为如下1) 4)中任一所述的DNA分子：
[0011] 1)编码区为序列表中序列1所示的核苷酸；
[0012] 2)编码区为序列表中序列3所示的核苷酸；
[0013] 3)在严格条件下与1)杂交且编码与上述蛋白具有相同功能蛋白的DNA分子；
[0014] 4)与1)具有90%以上同源性且编码与上述蛋白具有相同功能蛋白的DNA分子。
[0015] 上述严格条件为在6XSSC，0.5%SDS的溶液中，在65°C下杂交，然后用2XSSC， 0? 1 %SDS和IXSSC，0? 1 %SDS各洗膜一次。
[0016] 含有上述DNA分子的表达盒、重组载体、重组菌、转基因细胞系或重组菌也是本发 明保护的范围。
[0017] 上述重组载体为将上述DNA分子插入表达载体得到的重组载体。
[0018] 本发明的实施例中，重组载体将序列表中序列3所示的DNA分子插入pCAMBIA1300 载体的EcoRI和PstI酶切位点得到的载体，命名为TuVIPP10E-pCAMBIA1300。序列表中序 列3所示的DNA分子包括启动子CaMV35S、基因TuVIPPI和终止子0CS，其中，启动子CaMV35S 为序列表中序列3自5'末端第1-1427位核苷酸、基因TuVIPPI为序列表中序列3自5'末 端第1428-2429位核苷酸、终止子OCS为序列表中序列3自5'末端第2430-3207位核苷酸。
[0019] 上述的蛋白、上述DNA分子或上述的表达盒、重组载体、重组菌、转基因细胞系或 重组菌在调控植物光合作用和/或使植物开花和/或使植物结实和/或使植物产生内囊体 膜结构和/或使白化植物变为绿化植物中的应用也是本发明保护的范围。
[0020] 上述植物或所述白化植物均为拟南芥纯合突变体Atvippl(-/_)。
[0021] 上述的蛋白、上述DNA分子或权利要求4所述的表达盒、重组载体、重组菌、转基因 细胞系或重组菌在培育具有如下1)_3)中至少一种特征的转基因植物中的应用也是本发 明保护的范围：1)绿化表型；2)开花和/或结实；3)产生内囊体膜结构。
[0022] 本发明的另一个目的是提供一种培育开花和/或结实的转基因拟南芥的方法。
[0023] 本发明提供的方法，包括如下步骤：
[0024] 1)将上述的DNA分子转入杂合突变体AtvippK+/-)拟南芥中，得到转基因拟南 芥；
[0025] 2)将转基因拟南芥和杂合突变体Atvippl(+/_)播种培育后代，选取转基因拟南 芥AtvippK-/-)基因型的后代；
[0026] 所述转基因拟南芥Atvippl(-/_)基因型的后代具有如下A-C中至少一种表型：
[0027] A、所述转基因拟南芥Atvippl(-/_)基因型的后代为绿化植物；
[0028] B、所述转基因拟南芥Atvippl(-/_)基因型的后代能开花和/或结实；
[0029] C、所述转基因拟南芥AtvippK-/-)基因型的后代产生内囊体膜结构。
[0030] Atvippl基因型通过如下方法鉴定：
[0031] AtTuV10E-f和AtTuV10E-f扩增 798bpTuVIPPI基因；
[0032] AtVIPPl-f和AtVIPPl-r扩增 669bp的野生型AtVIPPl条带；
[0033] AtVIPPl-r和pCSA110LB3 扩增 525bpT-DNA插入片段；
[0034] 株系仅有525bp，为（-/-MtVIPPl基因型；
[0035] 株系有 669bp与 525bp，为（+/-MtVIPPl基因型；
[0036] 株系仅有669bp，为（+/+MtVIPPl基因型。
[0037] 株系有798bpTuVIPPI基因，为转基因植物。
[0038] 本发明的实验证明，本发明从二倍体乌拉尔图小麦中克隆了TuVIPPI基因，并通 过转基因互补拟南芥AtvipplT-DNA插入缺失突变体验证了该基因在内囊体发生中的关键 作用，可以促进植物光合作用，使白化植物绿化。
【附图说明】
[0039] 图1为TuVIPPlPCR产物电泳
[0040] 图2为突变体MS平板上生长7天的幼苗表型观察
[0041] 图3为突变体播种2周表型观察
[0042] 图4为突变体植株PCR鉴定电泳图
[0043] 图5为TuVIPP10E_pFGC5941载体结构示意图
[0044] 图 6 为TuVIPP10E_pCAMBIA1300 载体结构示意图
[0045] 图7为T1代转基因植株PCR检测
[0046] 图8为T2代转基因植株PCR检测
[0047] 图9为转TuVIPPI拟南芥的表型鉴定
[0048] 图10为野生型Col-O植株叶绿体结构
[0049] 图11为纯合突变体Atvippl(-/_)叶绿体结构
[0050] 图12为纯合突变背景下的转TuVIPPI植株叶绿体结构
【具体实施方式】
[0051 ] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0052] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0053] 实施例1、TuVIPPI的克隆与测序分析
[0054] 乌拉尔图小麦（Triticumurartu)品种Gl8I2(Draftgenomeofthewheat A-genomeprogenitorTriticumurartu。Hong-QingLing等，Nature、496 卷、7443 期、页码87-90。）的10天幼苗取叶片lOOmg，使用全式金公司EasyPurePlantRNA kit(Code#ER301_01)和TransScriptOne-StepgDNARemovalandcDNASynthesis SuperMix(Code#AT311-02)按操作指南提取总RNA，RT-PCR获得TuVIPPlcDNA全长，具体如 下：
[0055] 1、反转录
[0056] 以提取的总RNA为模板，按照如下反转录体系进行，得到cDNA。
[0057] 反转录体系为：
[0058] TotalRNA 5ul
[0059] 01ig〇-dTIul
[0060] RNase-freeWater 2ul
[0061] 离心管混匀上述溶液，65°C5分钟，冰浴2分钟，继续加入以下溶液，
[0062] 2XTSReactionMixIOul
[0063] TransScriptRT/RIEnzymeMixIul
[0064] gDNARemoverIul
[0065] 轻轻混匀，置42°C反应30分钟，85°C5分钟终止反应，4°C10分钟。
[0066] 取Iul反转录产物作为模板进行后续PCR反应。
[0067] 2、PCR扩增TuVIPPI片段
[0068] 克隆TuVIPPI所用引物为：
[0069] TuVIPPl