一种微生物饲料添加剂菌种的选育方法

专利名称：：一种微生物饲料添加剂菌种的选育方法
技术领域：
：本发明涉及的是微生物饲料添加剂菌种的选育方法，属于微生物学和动物营养与词料学领域。
背景技术：
：抗生素等饲料添加剂对预防动物疾病、提高动物生产性能和经济效益起到了巨大的推动作用，但同时也造成了严重的负面效应，比如病原微生物的抗药性，动物自身免疫力降低，药残引起的人体健康伤害以及排泄物污染环境等。随着生活水平的提高，人们对消费品的质量越来越重视，畜产品的安全问题日益成为人们关注的焦点。目前，欧盟已经禁止使用抗生素，而近年来，我国每年都有畜产品因药残超标而被退货或销毁，给国家及企业均造成了巨大的经济损失，由此可见，开发高效、无残留、无公害的安全绿色饲料添加剂是社会发展的要求和必然结果。微生物伺料添加剂又叫"动物微生态制剂"、"益生素"、"活菌制剂"，是由动物有益菌经工业化发酵生产的含有很多有益微生物及其代谢产物构成的活菌制剂，可以直接饲喂动物。此类制剂通过维持肠道内微生态的平衡而发挥作用，具有防病、增强机体免疫力、促进生长、增加体重等多种功能，且无污染，无残留，不产生抗药性，是一种绿色、安全的词料添加剂。而其中，优良菌种的选育又是微生物伺料添加剂开发与效果的关键。目前，国内外对益生菌菌种的研究多集中于研制产品和应用效果，按益生菌的特定要求来选育性能优良的菌株，研究菌株生物特性等关键指标方面报道不多；在动物饲料领域，国内外关于性能优良菌株的系统选育方法的研究报道更少，且已有的关于选育方法的报道多有其局限性，并没有将动物益生菌菌种的筛选标准与具体试验方法有机地结合起来，形成一套系统、完善、实际可操作性的微生物词料添加剂菌种选育方法，这也是本发明的创新之处。
发明内容本发明的目的在于提供一种科学合理、系统完善的、针对不同动物品种、年龄且具有一定特殊功能的优良菌株的选育方法。应用本方法，可选育出抗逆性好、功能强、功效显著的微生物伺料添加剂菌种新产品，为开发微生物饲料添加剂产品提供重要的菌种资源保证。本发明的目的通过如下技术方案实现本发明提供了一种微生物饲料添加剂菌种的选育方法，其特征在于包括菌株的分离与纯化、抗逆性选育、益生功能性选育、菌株鉴定和/或安全性研究。选育的具体过程如下1、菌株的分离与纯化首先根据微生物饲料添加剂菌种的使用目的确定所要益生菌菌种种类及菌种分离来源。如果在使用中不需要利用其黏附和定植特性，菌种的来源就不是个特别重要的问题，原则上，所要筛选的菌株最好是与原宿主、原生境、原微生态系、原微群落甚至原微种群相适应的菌种最理想。(1)增菌培养将少许样品种于液体培养基中，在28—4(TC恒温培养进行有氧或无氧增菌培养；(2)分离纯化对增菌培养物在平板培养基上进行划线培养，从中挑取各个形态不同的菌落再划线培养和分离，直至为纯菌落为止，将分离的纯菌落接种试管斜面中增殖，然后保存于4"C冰箱中，待用。菌种分离、纯化所用的培养基可以是BPY培养基、MRS培养基、98号培养基中的一种，上述各培养基的配方按其常规配方配制即可。2、对步骤l所分离、纯化的菌株进行抗逆性选育，可以对所分离、纯化的菌种直接进行抗逆性能测定，从中筛选出抗逆性强的天然优良菌种；或通过梯度培养逐渐增加溶液的酸性(至pH为1.5左右)及胆汁盐浓度，选出具有耐酸及耐胆汁特性的菌株；或通过传统的物理、化学诱变方法、现代基因工程技术，定向选育出抗逆性强的菌种；最后对选育出的菌株进行抗逆性性能测定。考虑到菌种的安全性和遗传性能稳定性，本发明倾向于直接筛选出抗逆性强的天然优良菌种。本发明所述的抗逆性选育是指包括抗动物体内生境、耐受干燥条件及剂型工艺操作条件、对饲料基质具有耐受性和/或药敏性的选育。其中，抗动物体内生境选育包括耐胃酸、耐胆盐、耐胰液和/或耐酶液的选育；耐受干燥条件及剂型工艺操作条件的选育是指耐受冷冻干燥、喷雾干燥的干燥条件及耐受颗粒料、片剂加工工艺操作条件的选育；对饲料基质具有耐受性的选育是指耐受饲料中的高铜和/或高锌矿物盐的选育；药敏性选育是指菌种对饲料中常添加的抗生素、在养殖过程中防治用的抗菌药物的药敏性选育。所述的耐胃酸选育是通过体外单一因子的模拟试验，即人工模拟胃液进行定性的生长性试验和存活率测定的定量测定筛选，筛选存活率在1%以上的优良菌株；耐胆盐选育是通过体外人工模拟肠液试验进行定性的生长性试验和存活率测定的筛选，是将菌种接种于不同胆盐浓度的人工模拟肠液中处理，筛选存活率在1%。以上的优良菌株；耐受颗粒料、片剂加工工艺操作条件的选育是指在耐受剂型加工过程中高温、高湿、机械挤压工艺操作条件下，检测各菌株的存活率，筛选存活率在90%以上的优良菌株。耐胃酸选育过程本发明优选如下方法保藏斜面菌种接种于装有10ml液体培养基的试管中，284(TC静置培养2024h，按510%接种量分别接种于9.59.0mLpH值2.0、3.0、4.0的人工模拟胃液中，Oh计数作对照，2h、6h取样用磷酸缓冲液按10倍系列稀释，进行平板活菌计数，计算存活率，筛选存活率在1%以上的优良菌株。耐胆盐选育过程本发明优选如下方法保藏斜面接种装有10mL液体培养基的试管中，37'C静置培养20-24h，按10%接种量分别接种于9.0mL0.03X、0.1%、0.2%、0.3%不同浓度的猪胆盐溶液中，Oh计数作对照，2h、6h取样用生理盐水按10倍系列稀释计数，进行平板活菌计数，计算存活率，筛选存活率在1%。以上的优良菌株。耐受颗粒料、片剂加工工艺操作条件优良菌株的选育本发明优选如下方法将菌株制成菌粉添加到预混料或全价料中进行制粒处理，检测各菌株的存活率，筛选活菌存活率在90%以上的优良菌株。药敏性选育本发明优选如下方法采用琼脂稀释法测定菌种对饲料中常添加的抗生素、在养殖过程中防治用的动物保健药物抗菌药物的药敏性，饲料中常添加的抗生素可以是磷酸泰乐菌素、硫酸黏杆菌素、土霉素、硫酸新霉素、磺胺二甲嘧啶、磺胺喹噁啉、黄霉素、喹乙醇、盐酸林可霉素、莫能菌素、吉他霉素、那西肽、有机砷；动物保健药品可以是金霉素、土霉素；药敏性选育的具体方法步骤如下(1)药物平板的配制无菌抗生素溶液的配制将待测抗生素用蒸馏水配制成不同的浓度，用细菌过滤膜过滤即得到无菌抗生素溶液；药物平板的配制根据试验设计，将不同浓度的抗生素溶液分别加入冷却至45-5(TC的BPY培养基中，充分摇匀倾倒灭菌平板，琼脂厚度3-4min，凝固后倒置空培24h待用。(2)接种物的制备菌种活化取保藏斜面上的菌种一环接种于装有5mLBPY液体培养基的试管中，37。C静止培养至对数中后期，使菌体量达到108CFU/mL。接种物的制备与接种将培养好的菌悬液，用无菌生理盐水l:IO稀释，摇匀，接种4uL于药物琼脂平板表面，每点菌数约为104CFU/mL，形成直径为5-8mm的菌斑。接种好后置37"C培养观察结果，正面培养5h后再倒置培养。结果判断将平板置于暗色、无反光物体表面上判断试验终点，以抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC。3、益生功能性选育菌种选育过程中，可以对待测菌株直接进行抗逆性能测定，从中筛选出抗逆性强的天然优良菌种；或通过传统的物理、化学诱变方法、现代基因工程技术，定向选育出益生功能强的菌株；最后对选育出的菌株进行抗逆性性能测定。考虑到菌种的安全性和遗传性能稳定性，本发明倾向于直接筛选出益生功能强的天然优良菌种。本发明所述的益生功能性选育包括抑菌效果、产酸测定、酶谱测定和/或黏附性能测定。其中，抑菌效果试验是用双碟法测定菌株对常见致病菌的抑菌效果，并筛选抑菌效果良好的优良菌株；产酸测定是采用离子色谱法分析测定发酵液中有机酸含量，并筛选产生乳酸、丁酸、乙酸或柠檬酸的优良菌株；酶谱测定是采用淀粉酶平板培养基进行高产淀粉酶优良菌株的初筛和/或采用酪素水解平板进行髙产蛋白酶优良菌株的初筛；黏附性能测定是将细菌用放射性同位素标记，而后再和细胞或粘液温育后，计算该菌的黏附百分率。其中，具体针对芽孢类菌的酶谱测定，包括淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、植酸酶或脂肪酶的测定，可根据所选育菌株的目的功效性来确定产酶种类菌种。淀粉酶的初筛过程本发明优选如下方法将菌种划线接种于淀粉酶试验培养基中，每个菌种接2个板，争取平板上一定要出现5个以上的单个菌落，以易于观察测量和计算透明圈；将接种好的上述平板置恒温箱中37。C培养24h—48h后分别滴加现配制的鲁格尔碘溶液，直至全部弥漫平板，稍停片刻，观察其菌落形成的透明圈，根据菌落周围产生的透明圈或变色圈直径与菌落直径的比值(H/C)大小，以判定各菌株的产酶能力。蛋白酶的初筛过程本发明优选如下方法取适当稀释度的菌悬液0.1mL于酪素水解培养基上，涂布均匀，然后37"C培养l-3d，观察菌落的形成、发育与酪素水解圈的大小，有透明圈者为阳性，无透明圈者为阴性，根据菌落周围产生的透明圈或变色圈直径与菌落直径的比值(H/C)大小，以判定各菌株的产酶能力。4、菌株鉴定菌株鉴定是用微生物学分类鉴定方法对选出菌株的形态以及生理生化特征进行研究，同时结合一种以分子为基础的鉴定方法。5、安全性研究安全性研究包括溶血试验、急性毒性试验和慢性毒性试验。本发明所述的菌种选育过程中所包括的步骤及各步骤所包括的筛选内容，在筛选一株菌株上并非必须全部包括，可根据菌种使用目的的不同，选择全部或一部分筛选内容，最终目的是选育出性能优良、功效良好的益生菌菌株。通过下列实施例将更具体的说明本发明，但是应理解所述实施例仅是为了说明本发明，而不是以任何方式限制本发明的范围。具体实施方式实施例1(1)芽孢类菌种的分离、纯化增菌培养将从仔猪的小肠、大肠和盲肠中靠近粘膜处取得的少许内容物，接种于BPY液体培养基中，在37'C恒温培养摇床中进行有氧增菌培养；分离纯化对上述增菌后的菌液在沸水中煮沸10min，再在BPY培养基平板上进行划线培养，从中调取各个形态不同的菌落再划线培养和分离，镜检是否有芽孢形成，是否为单菌落，将分离到的32株纯菌落且是芽孢菌接种BPY培养基试管斜面中增值，然后保存于4'C冰箱中，待用。BPY培养基的组成如下牛肉膏0.30.5g，酵母膏030.5g，蛋白胨0.5lg，氯化钠0.20.5§，葡萄糖0.30.5§，用自来水定容至100ml，固体培养基再加琼脂22.5g。(2)乳酸类菌种的分离、纯化增菌培养将从仔猪的小肠、大肠和盲肠中靠近粘膜处取得的少许内容物，接种于MRS液体培养基中，37-C恒温静止厌氧培养；分离纯化对上述增菌后的菌液在MRS培养基平板上进行划线培养，从中调取各个形态不同的菌落再划线培养和分离，直至为纯菌落为止，将分离的纯菌落接种MRS培养基试管斜面中培养，然后保存于4'C冰箱中，待用。镜检无芽孢形成，且过氧化氢酶试验为阴性，初步判断为乳酸类菌，共40株。MRS培养基的组成如下葡萄糖1520g;胰蛋白胨810g;牛肉膏510g;酵母提取物35g;柠檬酸二铵l2g;磷酸氢二钾l2g;MgS04.7H200.20.58g;MnS04.4H200.10.25g;吐温800.51mL;蒸馏水1L;固体培养基再加琼脂2025g。配制方法将MgS04.7H20、MnS044H20、葡萄糖以及吐温80以外的各成分溶解，冷至50°C，以醋酸调节pH值为6.06.5，而后加入MgS04.7H20、MnS04.4H20，最后加葡萄糖和吐温80。在121。C，高压灭菌20min。实施例2将实施例1种选育的共72株菌种进行抗消化道生境优良菌株的筛选(1)保藏斜面菌种接种于装有lOmL液体培养基的试管中，37'C静置培养20-24h，按10%接种量分别接种于9.0mLpH值2.0、3.0、4.0的人工模拟胃液中，Oh计数做对照，2h、6h取样用磷酸缓冲液按10倍系列稀释，进行平板活菌计数，计算存活率，筛选存活率在1%以上的优良菌株。人工模拟胃液的配制量取9.5%—10.5%浓盐酸16.4毫升，加蒸馏水至1000毫升，做基础人工胃液，用盐酸或氢氧化钠调pH值2.0、3.0、4.0，各取10mL(9mL)，分装于试管中，10(TC下蒸汽灭菌15分钟，在无菌条件下，每10mL液体中加入O.lOOg胃蛋白酶。(2)保藏斜面接种装有lOmL液体培养基的试管中，37°C静置培养20-24h，按10Vo接种量分别接种于9.0mL0.03X、0.1%、0.2%、0.3%不同浓度的猪胆盐溶液中，Oh计数做对照，2h、6h取样用生理盐水按10倍系列稀释计数，进行平板活菌计数，计算存活率，筛选存活率在lt以上的优良菌株。人工模拟肠液的配制0.85X生理盐水中各9mL，分装于试管中，121。C下蒸汽灭菌30分钟，在无菌条件下，制成0.03%、0.1%、0.2%、0.3%不同浓度的猪胆盐溶液。结果筛选出抗消化道生境的优良菌株有4株芽孢菌、3株乳酸菌，分别编号为DW-AQFB-1、DW誦RDYL-46、DW-USA/BT陽]0、DW-ZKY-55、DW隱SGY-49、DW画BLKY-27、DW國CMJ-47。实施例3对实施例2中筛选的7株菌种进行代谢产物的分析测定及益生性良好的优良菌株的筛选产酸测定采用离子色谱法分析测定发酵液中有机酸含量，筛选产生一定量的乳酸、丁酸、乙酸、柠檬酸有机酸的优良菌株，结果表明3株乳酸菌DW-SGY國49、DW-BLKY-27、DW-CMJ-47乳酸产量分别达9.132g/L、4.141g/L、3.758g/L，乳酸占总酸产量百分比分别为95%、85.5%、89.4%;4株芽孢菌DW-USA/BT-10、DW-RDYL-46、DW-AQFB-1、DW-ZKY-55的有机酸产量分别为1.230、0.298、1.814、1.695g/L。抑菌效果测定采用双碟法测定菌株对常见治病菌大肠杆菌K99、金黄色葡萄球菌、鸡白痢沙门氏菌的抑菌效果，筛选抑菌圈在7mm以上的抑菌效果良好的优良菌株，双碟法具体步骤如下(1)指示菌菌液的制备分别将在装有10mL营养肉汁培养基的试管中活化三株致病菌大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鸡白痢沙门氏菌，37。C恒温培养20h;(2)双层平板的制备取直径90mm的平板，注入灭菌的营养琼脂15-20mL，水平放置使之凝固，作为底层，另取营养琼脂(冷至5(TC左右)与37'C培养24h的指示菌液适量混匀，吸取10mL浇在底层培养基上，水平放置使之凝固，作为菌层；(3)加样品用无菌镊子夹取已灭菌的牛津杯，打开皿盖，放在培养基上。在牛津杯中加满相同量的菌种发酵上清液(约200uL)，每个样品3个重复。将加完样的双碟小心放入37t:恒温箱内，培养16-18h后，取出测量抑菌圈大小。结果表明2株乳酸菌和1株芽孢菌具有较好的抑菌作用，具体结果见表l。表13株选育菌株对致病菌的抑制效果<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>酶谱测定采用淀粉酶平板培养基进行对芽孢类菌进行高产淀粉酶优良菌株的初筛，采用酪素水解平板对芽孢类菌进行高产蛋白酶优良菌株的初筛，淀粉酶初筛平板培养基成分为牛肉膏25g，蛋白胨510g，氯化钠25g，可溶性淀粉1.52g,琼脂2025g，蒸馏水1000mL，pH7.2~7.4;酪素平板培养基牛肉膏68g，酵母粉1.52&多聚蛋白胨25g，氯化钠l2g，干酪素24g，琼脂1720g，蒸馏水1000mL，pH7.27.4。结果表明芽孢菌具有较高的蛋白酶活力，相对酶活力(H/C)为11.12。将2株乳酸菌DW-BLKY-27、DW-SGY-49和1株芽孢菌DW-ZKY-55在中国农业微生物菌株保藏管理中心(ACCC)进行鉴定，分别是粪肠球菌/mm似(ACCCNo.DW-BLKY-27)、植物乳杆菌L"c,"^7c'/〃"a//"rttor"附(CICC6026)和凝结芽孢杆菌B""〃"s(AS1.2407)。实施例4对实施例3中选育的凝结芽孢杆菌^ic/〃附aMw/朋s(AS1.2407)进行抗饲料加工试验将实施例3中的芽孢菌制成菌粉添加到5%预混料和全价料中进行制粒处理，检测存活率，结果表明其存活率92.3%。实施例5对实施例l一4选育的粪肠球菌E"^/w"(xm/"c化W"(ACCCNo.DW-BLKY-27)、植物乳杆菌丄"cto^"〃ws/7/朋to/，'(CICC6026)和凝结芽孢杆菌B""7/"scoflg"/"附(AS1.2407)进行安全性测定(1)溶血试验将菌株活化后接种于液体培养基，37。C振荡培养24h，取100pl菌液滴加到血平板中，37""C培养48h后观察有否透明圈。试验结果未见溶血现象。(2)急性毒性试验选16日龄北京当地柴鸡雏鸡60只，随机分为两组(试验组和对照组)，每组30只鸡，每组三个重复，每个重复10只鸡。试验组鸡每只肌肉注射lml试验菌株发酵液(10SCFU/ml)，另外每只每天口服lml发酵液(109CFU/ml),对照组鸡每只鸡注射lml蒸馏水并每天口服1.0ml空白培养基，两周后解剖。观察指标(1)动物的一般表现、体重、食物利用率。(2)血常规及生化指标红细胞计数、白细胞记数、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、尿素氮、肌酑、胆固醇、血糖、总蛋白、白蛋白。(3)病理解剖脏器系数、大体观察及病理组织检查(肝、肾、脾、法氏囊、十二指肠)。(3)慢性毒性试验选7日龄北京当地柴鸡雏鸡60只，随机分为两组(试验组和对照组)，每组30只鸡，每组三个重复，每个重复10只鸡。试验组每日每只鸡口服凝结芽孢杆菌(1.32X10SCFU/ml)菌液10ml，连续口服一个月，25天后给予各种应激增加饲养密度，泼凉水，对照组鸡每只鸡每天口服10ml培养凝结芽孢杆菌的培养基，密切观察鸡只全身状况。一个月后解剖。观察指标(1)动物的一般表现、体重、食物利用率；(2)血常规及生化指标红细胞计数、白细胞记数、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、尿素氮、肌酐、胆固醇、血糖、总蛋白、白蛋白；(3)病理解剖脏器系数、大体观察及病理组织检查(肝、肾、脾、法氏囊、十二指肠)。北京柴鸡雏鸡急性毒性实验及30天喂养试验期内，实验组血常规及血生化各指标均在正常范围内。大体观察各实验组动物的肝、肾、胃、肠、脾和卵巢/睾丸组织中，未见明显异常。病理组织学检査中，肝、脾、肾、法氏囊、十二指肠未见明显异常。本实验证明实施例l一4中筛选的2株乳酸菌和1株芽孢菌种是安全可靠的。其中凝结芽孢杆菌fi"c/〃"sflg"/""s(AS1.2407)的试验结果如表2、3、4所示。表2期初和期末平均体重、用料量<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>实施例6将实施例l一5选育的粪肠球菌(ACCCNo.DW-BLKY-27)、植物乳杆菌丄"cto^c/〃"s//"wtor"w(C1CC6026)和凝结芽孢杆菌fitfc/〃附"flg"/fl"s(AS1.2407)采用同位素标记法进行肠道定植和黏附性能的测定(1)制备标记菌株将的斜面保存菌种分别接种于BPY或MRS液体培养基，37X:培养24h后涂布于BPY或MRS平板培养36h，取单个菌落于液体培养基中37'C培养24h，得菌悬液，取9.9ml新鲜BPY或MRS液体培养基加0.1ml菌液，再加入10ulH3-TdR，37。C培养24h。2000rpm离心10min，取沉淀用NSS液离心洗涤3次，并稀释至107108CFU/mL，置4'C冰箱保存备用。(2)粘液的制备取l2ml粘液，所有粘液用Folin—酚法测定其蛋白含量，再用NSS液将其稀释到0.05mgPiVml，—20。C保存备用。(3)菌种的黏附取24孔细胞培养板，试验孔各加0.25ml粘液，用等量小牛血清蛋白代替粘液做阴性对照，4'C过夜固定，然后每孔加0.5mlNSS液洗涤两次，除去未黏附的粘液，每孔加等量0.251111标记菌悬液，每个样品做3个孔。另以0.25ml标记菌悬液做阳性对照，28孵育2h。再用0.5mlNSS洗去未黏附细菌。每孔加0.5Mpl50XSDS溶液，6(TC处理lh，洗脱培养板上的粘液。用液闪仪测定洗脱液中H^TdR含量，计算黏附百分率。CPM试验组—CPM阴性对照组黏附百分率-xioo%CPM阳性对照组—CPM阴性对照組结果表明待测3株菌种的黏附百分率分别为45.6%、50.3%、62.3%,具有较好的黏附性能。由筛选出的3株菌株粪肠球菌nterococcusfaecalis(ACCCNo.DW-BLKY-27)、植物乳杆菌Lactobacillusplantarum(C1CC6026)和凝结芽孢杆菌Bacilluscoagulans(AS1.2407)的抗逆性和益生功能性测定结果看出，对于预防和治疗仔猪下痢有一定的功效，但还需要做动物词喂试验进一步验证其功效性。实施例7凝结芽孢杆菌必《"7/附cw^"/"附(AS1.2407)对防治仔猪下痢的动物功效试验o试验动物选用35日龄断奶，体重在9kg左右的长白x大白杂交仔猪作为试验动物，共120头，出生日期相差不超过7天。试验设计采用随机单因子设计。试验分四组，每组有三个重复，每个重复10头断奶仔猪，组间和重复间体重差异不超过平均体重的5%。试验日粮采用玉米一豆粕型日粮作基础日粮，对照组词喂基础日粮，试验组I为在基础日粮上添加lX。凝结芽孢杆菌Bflc/〃Msafl^z/"m'(AS1.2407)菌粉，试验组II为在基础日粮上添加100g/T预防拉稀的抗生素阿散酸，试验组III为在基础日粮上添加lX。凝结芽孢杆菌Bflc/〃Msomg"/flm，(AS1.2407)菌粉+添加100g/T预防拉稀的抗生素阿散酸。基础日粮组成及营养水平见表5。伺养管理采用地面平养饲养，各组间除日粮不同外，其它条件完全一致，按常规进行。人工投料、自由采食、自由饮水，保持猪舍清洁。试验期30天，预饲期7天。表5饲喂基础日粮组成及营养水平<formula>formulaseeoriginaldocumentpage19</formula><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>测试指标及方法:在试验开始和结束时早晨空腹对猪只称重，分别以重复组为单位进行全群称重、计算耗料量、日增重、料肉比、腹泻率指标，并进行差异性显著检验。试验结果1.1生产性能试验仔猪的生产性能见表6。从表6可见在平均日增重仔猪试验组I、试验组II和试验组m比对照组分别提高6.7%、7.5%、9.5%;在料肉比方面试验组I、试验组II和试验组m比对照组分别降低7.5%、5.2%、8.0%;在腹泻率方面试验组I、试验组11和试验组111比对照组分别降低67.3%、47.7%、70.1%。试验组i与试验组n相比在日增重、料肉比方面差异不显著，但是在预防腹泻方面差异显著，说明凝结芽孢杆菌1.2407可以替代饲料中预防腹泻的抗生素。试验组m在日增重、料肉比和腹泻方面都好于试验组i、试验组ii和对照组，说明凝结芽孢杆菌1.2407与抗生素合用有协同作用。在平均耗料方面各组之间差异不显著。表6试验仔猪的生产性能<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>1.2经济效益试验猪的经济效益分析见表7。结果表明，试验组m的头均毛利润是最高的，从而看出在饲料中添加凝结芽孢杆菌1.2407的净增经济效益是显著的，试验组跟对照组相比分别提高了9.34%、9.12%、11.79%。本次试验凝结芽孢杆菌1.2407组与抗生素组相比在经济效益上差异不显著，可以完全替代抗生素，凝结芽孢杆菌1.2407在替代抗生素，减少药物残留，生产出绿色环保饲料具有很大的优势。<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>注.-仔猪每kg体重为10元，基础词料为1.80元/kg。权利要求1、一种微生物饲料添加剂菌种的选育方法，其特征在于包括菌株的分离与纯化、抗逆性选育、益生功能性选育、菌株鉴定和/或安全性研究。2、根据权利要求1所述的微生物伺料添加剂菌种的选育方法，其特征在于:抗逆性选育是指包括抗动物体内生境、耐受干燥条件及剂型工艺操作条件、对饲料基质具有耐受性和/或药敏性的选育。3、根据权利要求2所述的微生物词料添加剂菌种的选育方法，其特征在于:抗动物体内生境选育包括耐胃酸、耐胆盐、耐胰液和/或耐酶液的选育；耐受干燥条件及剂型工艺操作条件的选育是指耐受冷冻干燥、喷雾干燥的干燥条件及耐受颗粒料、片剂加工工艺操作条件的选育；对饲料基质具有耐受性的选育是指耐受饲料中的高铜和/或高锌矿物盐的选育；药敏性选育是指菌种对饲料中常添加的抗生素、在养殖过程中防治用的抗菌药物的药敏性选育。4、根据权利要求3所述的微生物饲料添加剂菌种的选育方法，其特征在于耐胃酸选育是通过体外单一因子的模拟试验，即人工模拟胃液进行定性的生长性试验和存活率测定的定量测定筛选，筛选存活率在1%以上的优良菌株；耐胆盐选育是通过体外人工模拟肠液试验进行定性的生长性试验和存活率测定的筛选，是将菌种接种于不同胆盐浓度的人工模拟肠液中处理，筛选存活率在1%。以上的优良菌株；耐受颗粒料、片剂加工工艺操作条件的选育是指在耐受剂型加工过程中高温、高湿、机械挤压工艺操作条件下，检测各菌株的存活率，筛选存活率在90%以上的优良菌株。5、根据权利要求1所述的微生物词料添加剂菌种的选育方法，其特征在于益生功能性选育包括抑菌效果、产酸测定、酶谱测定和/或黏附性能测定。6、根据权利要求5所述的微生物饲料添加剂菌种的选育方法，其特征在于-抑菌效果试验是用双碟法测定菌株对常见致病菌的抑菌效果，并筛选抑菌效果良好的优良菌株；产酸测定是采用离子色谱法分析测定发酵液中有机酸含量，并筛选产生乳酸、丁酸、乙酸或柠檬酸的优良菌株；酶谱测定是采用淀粉酶平板培养基进行高产淀粉酶优良菌株的初筛和/或采用酪素水解平板进行高产蛋白酶优良菌株的初筛；黏附性能测定是将细菌用放射性同位素标记，而后再和细胞或粘液温育后，计算该菌的黏附百分率。7、根据权利要求1所述的微生物饲料添加剂菌种的选育方法，其特征在于菌株鉴定是用微生物学分类鉴定方法对选出菌株的形态以及生理生化特征进行研究，同时结合一种以分子为基础的鉴定方法。8、根据权利要求1所述的微生物饲料添加剂菌种的选育方法，其特征在于安全性研究包括溶血试验、急性毒性试验和慢性毒性试验。全文摘要本发明属于微生物学和动物营养与饲料学领域，为微生物饲料添加剂菌种的选育方法，包括菌株的分离与纯化、抗逆性选育、益生功能性选育、菌株鉴定和/或安全性研究，该方法具有科学合理、系统完善、操作性强的特点，应用本方法，可选育出抗逆性好、功能强、功效显著的微生物饲料添加剂菌种新产品，为开发微生物饲料添加剂产品提供重要的菌种资源保证。文档编号A23K1/16GK101392223SQ20071012211公开日2009年3月25日申请日期2007年9月21日优先权日2007年9月21日发明者宇刘,琨姚,孙占敏,宋维平,张玳华,白玉卿,云莫,贾秋英,军赵,赵雁青申请人:北京大北农科技集团有限责任公司