专利名称：一种通过幼苗诱导的愈伤对玉米进行基因转化的方法
技术领域：
本发明涉及一种通过幼苗诱导的愈伤对玉米进行基因转化的方法。
背景技术：
转基因植物是指采用基因工程手段将从不同生物中分离或人工合成的外源基因在体外进行酶切和连接，构成重组DNA分子，通过微生物介导、人工原生质体、显微注射以及基因枪轰击等方法，直接导入到植物体细胞内或组织中，使新的基因在植物细胞或组织内整合、表达，并能通过无性或有性增值过程，将外源基因遗传给后代，由此获得基因改良植物，使之稳定遗传并赋予植物新的农艺性状，如抗虫、抗病、抗逆、高产、优质等。这一技术克服了植物有性杂交的限制，使基因交流的范围无限扩大，可将从细菌、病毒、动物、远缘植物、人类甚至人工合成的基因导入植物，所以其应用前景十分广阔(Twyman，2003 ； ffalmsley,2000)。转基因植物技术及其产品是当今世界农业生物技术研究与产业化开发的重点和热点，是我国农业科技革命的核心内容之一，对我国农业科技手段的更新换代以及农业产业结构的调整具有重要的战略意义。随着现代生物技术的迅速发展，植物转基因技术方兴未艾，因而对它的研究意义也显得尤为重要。1986年Fromm等(1986)利用电击法首次将抗除草剂pat基因转入玉米原生质体中，获得了稳定整合和表达的愈伤组织，实现了玉米遗传转化的重大突破，但是没有获得转化植株。1988年Rhodes等(1988)首次获得玉米转基因完整植株，随后Prioli等(1989)、Shillito等(1989)、Fromm等(1990)分别于1989年和1990年报道获得了可育的玉米转化植株。到目前为止，世界转基因玉米研究已经从转化方法的探索发展到商品化阶段。在短短20年的时间里，玉米转化受体、转化方法以及目的基因应用等各方面的研究都取得了迅速发展。玉米遗传转化的方法按其是否需要通过组织培养、再生植株可分成两大类，第一类需要通过组织培养再生植株，常用的方法有农杆菌介导转化法、基因枪法；另一类方法不需要通过组织培养，目前比较成熟的主要有花粉管通道法。农杆菌介导的遗传转化过程主要包括5个步骤(顾红雅，1997) (I)细菌在植物敏感细胞上吸附；(2)农杆菌中Ti质粒的vir区被激活；(3) T-DNA的切割和T-DNA复合物的形成；(4)T-DNA复合物由农杆菌进入植物细胞；(5)T-DNA整合到染色体上并进行表达。选择和建立良好的植物受体系统是基因转化能否成功的关键因素之一。所谓植物基因转化受体系统，是指用于转化的外植体通过组织培养途径或其它非组织培养途径，能高效、稳定地再生无性系，并能接受外源DNA整合，对转化选择抗生素敏感的再生系统。目前用于玉米基因转化的受体系统主要有以下几种(I)胚性愈伤组织1949年LaRue (1949)用甜玉米的胚乳作外植体首次诱导出愈伤组织，但最终未获得再生植株。直到Green等(1975)用A188的幼胚作外植体，诱导出二倍体愈伤组织，并获得再生植株，从此，玉米组织培养技术不断完善。愈伤组织由外植体诱导形成，有两种类型，大多数玉米自交系易形成致密的I型愈伤组织，这种愈伤组织胚性差，继代后较难再生出植株；另一种松脆的II型愈伤组织生长迅速，可以长期继代保持胚性，便于产生胚性悬浮细胞系，继而制备原生质体，虽然玉米II型愈伤组织的诱导受到基因型的影响，但其仍是目前玉米转化的常用受体，具有较高的转化频率和再生频率。愈伤组织多是以幼胚作外植体诱导产生而来，比较容易获得，再生能力较强，获得转化植株的周期相对较短，仍然是目前应用最广泛的受体材料。Huang等(2004)利用成熟胚建立高效的再生体系时也在成熟胚中获得了较高的胚性愈伤组织发生率，因此对便于操作的成熟胚进行研究，诱导胚性愈伤组织可能有会建立理想的转化受体系统。由于胚性愈伤组织再生能力较强，容易大量繁殖，获得转化植株的周期较短，是目前应用最广泛的受体材料之一。但是，从外植体诱导的愈伤组织常是由多细胞形成，本身就是嵌合体，因而分化的不定芽嵌合体比例更高，这就使筛选转基因再生植株的难度加大。再者，愈伤组织所形成的再生植株无性系变异较大，转化的外源基因遗传稳定性较差，为了克服这种困难，有人提出几种方法，如借助非转化正常植株的花粉授粉、延长生长过程、使其 尽量减少变异等。⑵幼胚玉米幼胚具有较强的生活状态，也是进行遗传转化很好的受体材料。未成熟胚的盾片再生植株的能力很强，玉米幼胚可通过短时间的愈伤化而不经过愈伤组织阶段即可直接再生植株，其中长度在I. 0-2. Omm的玉米幼胚是用农杆菌介导转化的最佳尺寸网。玉米的基因型、幼胚的大小及植株的发育状态是影响玉米幼胚培养植株再生的重要因素，其中基因型影响尤为突出，这就需要大量筛选玉米品种，找出最适合转基因的基因型。自从1996年Ishida等(1996)首次用农杆菌转化玉米自交系A188的幼胚，获得了转基因植株以来，幼胚转化体系已被广泛应用于国内外玉米转基因工作中。Zhao等(2002)在农杆菌介导玉米幼胚转化的过程中，对转化条件和培养基成分进行了优化，幼胚转化率达到32. 8%。吴敏生(2001)，Lozvaya(2006)，赵云云(2006)等针对不同基因型玉米幼胚的组织培养体系进行研究为玉米转基因技术提供了高效稳定的转化受体系统。(3)茎尖分生组织茎尖分生组织培养始于上世纪40年代，是植物组织培养中的常规技术。用茎尖分生组织作转化受体，具有基因型依赖性较小、遗传较稳定、分化成苗率较高、且取材不受季节限制等优点，能够克服我国目前生产上常用的玉米自交系存在的胚性愈伤组织诱导频率不高、胚性愈伤组织继代过程中胚性易丧失、再生植株中出现大量体细胞无性系变异等问题，是一种很有发展前景的遗传转化受体系统。Gould等(1991)用gus报告基因和Npt基因通过农杆菌介导法转化玉米Funk G90的芽尖，得到的再生植株及其子一代基因组中带有标记基因，为建立玉米高效遗传转化体系奠定了基础。Low等(1995)以玉米茎尖分生组织为受体，把DNA转移到早期合子胚的分生组织中，直接分化再生系统省去了愈伤诱导培养过程，体细胞无性变异小，获得再生株的周期短，但玉米茎尖的培养困难。李国圣等(2000)以玉米优良自交系为材料，用芽尖分生组织诱导出胚状体和丛生芽，建立起一种快速有效的玉米丛生芽诱导与遗传转化体系，并用基因枪将抗除草剂als基因转入玉米细胞，获得转基因再生植株。Sairam等(2003)报道了一个快速高效的农杆菌转化的体系，不经过诱导愈伤阶段，直接用农杆菌转化玉米茎尖，也获得了转基因再生植株。直接再生分化系统省去了愈伤诱导培养过程，体细胞无性变异小，获得再生植株的周期短。Sidorov等(2006)用玉米茎尖诱导出愈伤组织，再用农杆菌转化愈伤组织，获得了可以遗传的转基因玉米。但是玉米茎尖起源于多细胞，所形成的再生植株嵌合体多，这是该受体系统的一大缺点。玉米未成熟胚培养获得的胚性愈伤组织具有良好的继代能力和再生植株能力，但其受地理条件、生长季节、发育阶段以及基因型的严重影响，削弱了实用性，不便于研究工作的进展。以玉米成熟胚为外植体诱导的愈伤组织作为遗传转化受体，获取植株的周期短、取材方便、不受生长季节限制、灭菌容易、外植体均匀、重复性好、再生植株频率高，是一种比较理想的适合于玉米遗传转化的再生体系。这不仅可以对玉米的遗传研究工作带来方便，而且对转基因研究和其他生物学研究以及拓宽在杂交育种中的应用奠定基础。建立玉米芽尖培养体系和遗传转化体系将是玉米转基因研究的一大热点。(4)原生质体植物原生质体是除去细胞壁后的“裸露”细胞，具有全能性，能在适宜的条件下再 生出植株。由于去除了细胞壁的障碍，人们利用物理或化学方法(电激法、PEG法、显微注射法等)，使外源DNA能有效地通过植物裸露的原生质体膜，整合到细胞染色体上，实现基因的遗传转化。原生质体作为受体材料，外源DNA能较容易地进入，培养出来的细胞，常分裂形成基因型一致的细胞克隆，因此得到的转基因植株嵌合体少。Fromm等(1986) ,Rhodes等(1988)，Prioli (1959)分别成功地以玉米的原生质体为受体，对玉米进行遗传转化。原生质体作为受体进行转化，方便易行，转化效率比较高。但是，其中也存在一些问题(I)原生质体培养技术难度大，周期长，植株再生困难；(2)原生质体培养形成的细胞无性系变异强烈，遗传稳定性差；(3)原生质体再生植株自交结实困难。这些因素限制了玉米原生质体在基因工程中的广泛应用和发展。近几年来，随着其它受体系统的发展，原生质体已经很少被使用。(5)种质受体种质受体指转基因利用的受体是植物自身的生殖系统，如花粉粒、卵细胞，也称生殖细胞受体系统。现已建立了多种直接利用花粉和卵细胞受精过程进行基因转化的方法，如花粉管通道法。利用种质系统进行转化可以简化遗传转化过程，避开了组织培养，缩短了实验周期；生殖细胞接受外源遗传物质的能力比较强，导入外源基因的成功率高，更易获得转基因植株生殖细胞是单倍体细胞，转化的基因无显隐性影响，能使外源基因充分表达，加速纯合体的获得。但是，这种受体系统也有不利之处，例如转化后代群体较大，需要有简便、可靠的筛选方法；利用植物自身生殖细胞进行遗传操作只能在短暂的开花期内进行受到季节的限制。除了上述转基因受体材料，近年来，科学家建立了许多以作物种子为起始材料的转基因体系。例如，从水稻、黑小麦种子中的成熟胚或盾片诱导胚性愈伤，这种愈伤可以通过基因枪或农杆菌介导的方法进行转化。此外，以萌发的大麦、燕麦、小麦、谷子、肯塔基六月草和兰花草种子为起始材料诱导胚性愈伤，而蓝格兰马草、高粱和小麦从幼苗上分离的茎段可以用于诱导分生组织。科学家建立了高效的玉米种子诱导的茎分生组织的体系，以该茎尖分生组织为外植体，科学家成功地建立了基因枪转化体系。
发明内容
针对上述缺点，本发明提供一种本发明的目的之一是通过以下技术方案来实现的将消毒过的种子摆放在灭菌的滤纸上，用消毒灭菌的医用镊子将消毒过的玉米种子转移到萌发培养基上，靠近胚乳一侧朝下，靠近胚的一侧朝上；将摆放好种子的培养皿置于光照培养箱中，光强80-100 μ E，光周期16h光照/8h黑暗，27-28°C下培养7d。选取萌发较好的幼苗用于顶端分生组织(幼苗节点区域)愈伤诱导，在无菌的50ml的离心管中，用镊子小心加入继代7d左右、生长良好的胚性愈伤组织，加入含乙酰丁香酮的侵染培养基，黑暗中放置lh。缓慢吸去侵染培养基，加入适量的上述制备好的农杆菌菌液(以至少浸过愈伤组织为宜)，盖上离心管盖，轻轻上下颠倒lmin，黑暗处放置lOmin。用Iml移液器小心吸去菌液，将侵染过的愈伤组织转移到灭过菌的5层滤纸上。待愈伤上的菌液被完全 吸净后，将侵染后的愈伤转移到共培养培养基上，培养基用封口膜封口后于25°C、黑暗条件下共培养3d,共培养3d后的愈伤组织,依次用含有250mg/l噻孢霉素的无菌蒸懼水、无菌蒸懼水洗涤2次，用无菌的滤纸吸净培养基上残留的水分，转入到恢复培养基上，封口后于25°C、黑暗条件下恢复培养7d。侵染后的愈伤在恢复培养基上培养7d后，转移到筛选培养基上(培养基配方见附表I)，每10个愈伤放置于I个筛选培养基中在28°c、黑暗条件下培养，每14d为I个筛选周期，更换一次筛选培养基，其中AgN03(100yM)间隔添加。筛选期间，对于愈伤变褐的部分要及时切除，筛选结束后，剔除严重水溃化、发黑、发褐的愈伤组织，将抗性愈伤组织转移到筛后恢复培养基上，在28°C、黑暗条件下培养14d。将恢复14d的所有抗性愈伤组织转移到筛后诱导培养基，在28°C、黑暗条件下培养14d。进行抗性愈伤分化、转化苗生根培养、转化苗移栽。
下面结合附图对本发明的具体实施例作进一步详细的说明。图I.种子消毒装置图2.玉米幼苗愈伤再生图3.玉米幼苗愈伤转化图4. PCR 检测
具体实施例方式以下将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述；应当理解，优选实施例仅为了说明本发明，而不是为了限制本发明的保护范围。(I)玉米种子的消毒挑选饱满、整洁且经过杀菌剂处理的玉米种子，置于500ml三角瓶中，向三角瓶中加入75%乙醇，振荡浸泡811^11。倒掉酒精，向三角瓶中加入O. 1% HgCl2溶液，振荡浸泡20min。将三角瓶移至超净工作台，倒掉HgC12溶液，用无菌水冲洗6次。在超净工作台中，将消毒过的种子摆放在灭菌的滤纸上，使种子上残留的水分缓慢挥发。或者将消毒过的种子或者在通风橱中用氯气消毒装置进行消毒。在启普气体发生器的的锥形瓶(500ml)中，加入200ml未稀释的次氯酸钠(6. 15%有效成分)，在锥形瓶上方的球形漏斗中加入4ml浓盐酸，在氯气消毒装置中间的锥形瓶中放入200g饱满、整洁且杀菌剂处理的玉米种子。缓慢拧开球形漏斗的阀门，使浓盐酸缓慢滴下，产生氯气。氯气消毒30min后，关闭启普气体发生器，拆分氯气消毒装置，盛放种子的锥形瓶用封口膜封口，放置3h，然后将三角瓶转移到超净工作台中，打开封口膜，使种子表面的残余氯气缓慢挥发。(2)玉米种子的萌发在超净工作台中，用消毒灭菌的医用镊子将消毒过的玉米种子置于转移到萌发培养基上，每个培养基上均匀摆放10粒玉米种子，靠近胚乳一侧朝下，靠近胚的一侧朝上；摆放完毕后，用Parafilm M封口膜将培养皿封闭。将摆放好种子的培养皿置于光照培养箱中，光强80-100 μ E，光周期16h光照/8h黑暗，7-28°C下培养7d。(3)胚性愈伤的诱导与继代 种子萌发7d后，在超净工作台中，选取萌发较好的幼苗用于顶端分生组织愈伤诱导。打开摆放了萌发玉米种子的培养皿，用镊子将这10个萌发的种子转移到一个新的、消毒灭菌过的培养皿中；用镊子固定好萌发的种子，用手术刀片切下顶端分生组织(幼苗节点区域)上、下约5_的切段。将切段沿轴线纵切，切面朝下摆放在愈伤诱导(继代)培养基上，每个培养基摆放10-20个纵切后的切段，置于人工气候箱中，在光强80-100 μ E，光周期16h光照/8h黑暗，27-28°C的条件下培养(附图2B)。培养2 4周后，剥离诱导出的愈伤，在显微镜下观察，挑选胚性愈伤(附图2C)，并将胚性愈伤置于新鲜的愈伤诱导(继代)培养基上，28 °C黑暗培养2-3周。将胚性愈伤组织转移到分化培养基中，用镊子将每个抗性愈伤夹碎成2 6块，每个培养基摆放1-5个胚性愈伤。在光强80-100 μ Ε，光周期16h光照/8h黑暗(12h/12h)，28°C的条件下分化培养。各个基因型的受体材料会在4-28d不等的时间分化出绿芽。对于没有夹碎的愈伤上会分化出多个幼苗，及时用镊子将这些幼苗分开，并将新分开的幼苗转移到新的分化培养基上。在分化培养基上，若长出细根，必须及时切去，否则不能分化出更多的小苗。(4)侵染用农杆菌菌液的制备将保存于-80 0C冰箱、携带有植物转化载体的农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens，LBA4404菌株或EHA105菌株)菌液在YEB固体培养基(添加链霉素50mg/L ；根据转化载体上携带的抗性基因添加100mg/L卡那霉素或100mg/L氨苄青霉素)上划线。划过线的培养基用封口膜(ParafilmM )封口，28°C、黑暗条件下倒置培养2d。将培养农杆菌的平板转移到4°C冰箱中保存(在4°C冰箱中的保存时间不能超过4d，以避免可能发生的质粒重组)。在侵染愈伤前2d傍晚，挑取单菌落置于装有25ml YEB液体培养基(添加IOOmg/L对应的各种抗生素)的250ml三角瓶(西安延河)中。三角瓶置于转速为150rpm的恒温摇床(Thermo)中、26 °C过夜培养。次日上午，将农杆菌培养物按照I : 5的比例稀释(取出IOml菌液加入到40ml新鲜的YEB液体培养基中)后按照相同的条件继续培养。当天傍晚，在将这50ml农杆菌菌液均分到2个50ml离心管中(eppendorf), 3500rpm离心15min。移去上清液，用IOml预侵染培养基(200 μ M乙酰丁香酮，50mg/L对应的各种抗生素)悬浮管底的菌体。用液体预侵染培养基将悬浮菌液浓度稀释到OD66tl = O. 2。在250ml三角瓶中，用预侵染培养基将稀释的菌液体积补齐到50ml。三角瓶置于转速为150rpm的恒温摇床(Thermo)中、26°C过夜培养。第三天早上(侵染当天)，3500rpm离心15min。移去上清液,用1020ml预侵染培养基(200 μ M乙酰丁香酮)悬浮管底的菌体。并将菌液浓度调至OD66tl = O. 5。(5)农杆菌侵染胚性愈伤在无菌的50ml的离心管中，用镊子小心加入继代7d左右、生长良好的胚性愈伤组织(每个离心管大约装入10ml)，加入含乙酰丁香酮的侵染培养基，黑暗中放置lh。用Iml移液器缓慢吸去侵染培养基，加入适量的上述制备好的农杆菌菌液(以至少浸过愈伤组织为宜)，盖上离心管盖,轻轻上下颠倒lmin,黑暗处放置lOmin。用Iml移液器小心吸去菌液， 将侵染过的愈伤组织转移到灭过菌的5层滤纸上。待愈伤上的菌液被完全吸净后，将侵染后的愈伤转移到共培养培养基上，培养基用封口膜封口后于25°C、黑暗条件下共培养3d。(6)侵染后的恢复共培养3d后的愈伤组织，依次用含有250mg/l噻孢霉素的无菌蒸馏水、无菌蒸馏水洗涤2次，用无菌的滤纸吸净培养基上残留的水分，转入到恢复培养基上，封口后于25°C、黑暗条件下恢复培养7d。(7)抗性愈伤的筛选侵染后的愈伤在恢复培养基上培养7d后,转移到筛选培养基上,每10个愈伤放置于I个筛选培养基中在28°C、黑暗条件下培养，每14d为I个筛选周期，更换一次筛选培养基，其中AgNO3(IOOyM)间隔添加。筛选期间，对于愈伤变褐的部分要及时切除。(8)筛选后恢复、诱导阶段筛选结束后，剔除严重水溃化、发黑、发褐的愈伤组织，将抗性愈伤组织转移到筛后恢复培养基上，在28°C、黑暗条件下培养14d。将恢复14d的所有抗性愈伤组织转移到筛后诱导培养基，在28°C、黑暗条件下培养14d。TO代转基因植株PCR检测提取TO代转基因植株叶片DNA。随即选取各个植物转化载体转化的TO代转基因植株。用特异性引物对抗性标记基因及目的基因进行PCR扩增。随机选取p3301ZmERD4转化的植株80株，提取叶片基因组DNA，用Bar基因特异性引物(BarF/BarR)进行PCR扩增，74株为PCR阳性，扩增出与质粒对照大小的片段(370bp)，而未转化植株没有扩增出相应的片段。部分转化植株PCR结果如附图4A所示其中，M为DL2000DNA ladder ;泳道I为未转化植株，泳道2为质粒p3301ZmERD4阳性对照。同样地，随机选取pl300ihpZmGW2转化的植株100株，提取叶片基因组DNA，用Hpt基因特异性引物(Hptll293S/Hptll628A)进行PCR扩增，96株为PCR阳性，扩增出与质粒对照大小的片段(310bp)，而未转化植株没有扩增出相应的片段。部分转化植株PCR结果如附图4B所示其中，M为DL2000DNA ladder ;泳道I为未转化植株，泳道2为质粒pl300ihpZmGW2 阳性对照。对所有抗性基因PCR检测呈阳性的转化植株，进一步PCR检测目的基因。
权利要求
1.一种通过幼苗诱导的愈伤对玉米进行基因转化的方法，该方法包括以下步骤 (1)玉米种子的消毒、萌发； (2)胚性愈伤的诱导与继代； (3)制备侵染用农杆菌菌液并侵染胚性愈伤； (4)侵染后的恢复； (5)抗性愈伤的筛选； (6)筛选后恢复、诱导； (7)抗性愈伤分化； (8)转化苗生根培养； (9)转化苗移栽。
2.如权利要求I所述的通过幼苗诱导的愈伤对玉米进行基因转化的方法，其特征在于农杆菌菌液侵染胚性愈伤的过程为取生长良好的胚性愈伤组织，加入含乙酰丁香酮的侵染培养基，黑暗中放置lh，吸去侵染培养基，加入农杆菌菌液，上下颠倒lmin，黑暗处放置lOmin，吸去菌液，将侵染过的愈伤组织转移到灭过菌的5层滤纸上，待愈伤上的菌液被完全吸净后，将侵染后的愈伤转移到共培养培养基上，培养基用封口膜封口后于25°C、黑暗条件下共培养3d。
3.如权利要求I所述的通过幼苗诱导的愈伤对玉米进行基因转化的方法，其特征在于侵染后的恢复过程为把共培养3d后的愈伤组织，依次用含有250mg/l噻孢霉素的无菌蒸馏水、无菌蒸馏水洗涤2次，用无菌的滤纸吸净培养基上残留的水分，转入到恢复培养基上，封口后于25°C、黑暗条件下恢复培养7d。
3.如权利要求I所述的通过幼苗诱导的愈伤对玉米进行基因转化的方法，其特征在于抗性愈伤的筛选过程为侵染后的愈伤在恢复培养基上培养7d后，转移到筛选培养基上，在28°C、黑暗条件下培养，每14d为I个筛选周期，更换一次筛选培养基，其中AgNO3间隔添加，筛选期间，对于愈伤变褐的部分要及时切除。
4.如权利要求I所述的通过幼苗诱导的愈伤对玉米进行基因转化的方法，其特征在于筛选后恢复、诱导过程为筛选结束后，剔除严重水溃化、发黑、发褐的愈伤组织，将抗性愈伤组织转移到筛后恢复培养基上，在28°C、黑暗条件下培养14d，将恢复14d的所有抗性愈伤组织转移到筛后诱导培养基，在28°C、黑暗条件下培养14d。
全文摘要
本发明以玉米种子萌发的幼苗切段为起点，通过种子的消毒与萌发，愈伤的诱导与继代，愈伤的侵染和共培养，愈伤的抗性筛选和愈伤分化和生根来获得玉米转基因植株。本发明可以克服玉米转基因受体材料生长季节、基因型等的限制，基因转化效率较高，适宜进行大规模基因转化事件，具有重要的理论与实际意义。将在玉米转基因工程中发挥重要的作用，应用前景广阔。
文档编号A01H5/00GK102911964SQ20121044169
公开日2013年2月6日 申请日期2012年11月8日 优先权日2012年11月8日
发明者曹言勇, 李会勇, 李晶晶, 王利锋, 张永辉, 王浩 申请人:河南省农业科学院