本申请要求2014年1月10日提交的第61/925,764号美国临时申请的优先权，其公开内容通过引用并入本文。
发明领域
本发明涉及(S)-3’-甲基-脱落酸(“(S)-3’-甲基-ABA”)及其酯，以及使用和合成这些化合物的方法。
发明背景
脱落酸(“ABA”)是天然存在的植物生长调节剂，其调节广泛的植物生理过程例如种子发芽、幼苗伸长、非生物胁迫反应、开花和果实发育。天然存在并且具有生物学活性形式的ABA为S对映体，(S)-脱落酸(“(S)-ABA”)。因此，已经确定(S)-ABA在园艺学和农艺学中的各种商业应用。通过与(S)-ABA受体结合并且激活细胞信号转导级联，(S)-ABA发挥其生物活性。此外，已经证明(S)-ABA具有药物和营养应用(参见第8,536,224号美国专利)。
ABA的合成类似物可以表现出与(S)-ABA相似的生物活性，但是具有改变的(增强的)效能(ABA激动剂)或者具有不同于(S)-ABA自身所具有的对多种ABA受体的亲和力的谱。合成类似物还可以具有改善的植物组织摄取以及增强的代谢稳定性。此外，合成类似物可以比(S)-ABA具有更好的化学稳定性和环境稳定性。因此，合成的ABA类似物可以具有独特的生物活性并且已经寻求作为鉴定新颖的植物生长调节剂的途径。
在公共领域中已披露了ABA的各种合成类似物。若干日本研究组通过从头合成已经合成出具有侧链修饰和/或环己烯酮环取代基的ABA类似物(Y.Todoroki等人，Phytochem.1995,38,561-568；Y.Todoroki等人，Phytochem.1995,40,633-641；S.Nakano等人，Biosci.Biotech.Biochem.1995,59,1699-176；Y.Todoroki等人，Biosci.Biotech.Biochem.1994,58,707-715；Y.Todoroki等人，Biosci.Biotech.Biochem.1997,61,2043-2045；Y.Todoroki等人，Tetrahedron,1996,52,8081-8098)。还已经报道了由(S)-ABA合成(S)-3’-卤素-ABA、(S)-3’叠氮基-ABA和(S)-3’-烷硫基-ABA(Y.Todoroki等人，Tetrahedron,1995,51,6911-6926；S.Arai等人，Phytochem.1999,52,1185-1193；J.J.Balsevich等人，Phytochem.1977,44,215-220；Y.Todoroki等人，Tetrahedron,2000,56,1649-1653；Y.Todoroki等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.2001,11,2381-2384)。由S.R.Abrams及其合作者在加拿大国家研究委员会植物生物技术研究所完成的工作也是值得注意的。使用从头合成的方法，已经制备了具有侧链修饰或者C6’取代的ABA类似物作为外消旋混合物，或者在一些情况下，作为纯的立体异构体(参见第5,518,995号美国专利；D.M.Priest等人，FEBS Letters,2005,579,4454-4458)。还描述了其中(S)-ABA的环己烯酮环被双环四氢萘酮环替代的四氢萘酮系列的类似物(J.M.Nyangulu等人，Org.Biomol.Chem.2006,4,1400-1412；J.M.Nyangulu等人，J.Am.Chem.Soc.2005,127,1662-1664；WO2005/108345)。
在文献中报道的合成的ABA类似物局限于一定的范围，并且通常经由多步从头合成而制备。通常所述合成具有低的总收率，特别是当需要光学纯的单一对映体时。因此，在大量合成或者在商业规模上制造的情况下这些化合物通常是昂贵的，这限制了它们的商业应用。本发明的(S)-ABA类似物具有上述生物活性，并且更重要的是可以由(S)-ABA进行有效制备，其直到最近还无法大量获得。
外消旋(±)-3’-甲基-ABA的生物活性已经在出版物中进行了简要描述(K.Ueno等人，Bioorg.Med.Chem.2005,13,3359-3370)，但是该化合物的合成还未经报道。根据Ueno等人，(±)-3’-甲基-ABA在水稻幼苗伸长测定中表现出与(S)-ABA相同的活性，并且在(S)-ABA 8’-羟化酶抑制测定中表现出比(S)-ABA更弱的活性。此外，文章中印出了可以解释为表示(S)-3’-甲基-ABA的结构(Y.Todoroki等人，Bioorg.Med.Chem.Lett,2001,11,2381-2384)，但是在公共领域中既没有描述该化合物的合成也没有描述该化合物的任何生物学数据。因此，在公共领域中不存在能够合成(S)-3’-甲基-ABA及其酯的现有技术或者教导(S)-3’-甲基-ABA及其酯的生物活性的现有技术。最重要地，基于在公共领域中的所有可获得的信息(参见上文)，(S)-3’-甲基-ABA将提供优于(S)-ABA或者(±)-3’-甲基-ABA的任何优势在进行本发明的时候对于本领域的技术人员来说并非显而易见。
因此，对于可以是(S)-ABA的激动剂并且具有改善的生物活性的对映体纯的(S)-3’-甲基-ABA类似物存在需求。还对制备(S)-3’-甲基-ABA及其酯的方法存在需求。
附图简述
图1在0.3ppm(S)-ABA和类似物存在时拟南芥(Arabidopsis)种子发芽情况，其为由以下实施例5所述的种子发芽测定中的数据产生的图。
发明概述
申请人已发现对映体纯的(S)-3’-甲基-脱落酸及其酯以及合成这些化合物的方法。
在一个方面，本发明涉及式I的化合物：
其中R为氢、取代或未取代的烷基、环烷基、杂环烷基、烯基烷基、炔基烷基、烯基、环烯基、杂环烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳基烷基或者杂芳基烷基；
及其盐。
在另一方面，本发明涉及调节植物生长的方法，其包括向需要生长调节的植物应用有效量的任何本发明的化合物。
在另一方面，本发明涉及通过化学合成来制备本发明的化合物的有效方法。
发明详述
本发明的化合物为对映体纯的且相对易于合成的(S)-ABA类似物。本发明的合成方案还提供良好的收率。
在一个实施方案中，本发明涉及式I的化合物：
其中R为氢、取代或未取代的烷基、环烷基、杂环烷基、烯基烷基、炔基烷基、烯基、环烯基、杂环烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳基烷基或者杂芳基烷基；
及其盐。
在优选实施方案中，R为氢。
在另一优选实施方案中，R为烷基。在更优选的实施方案中，R为低级烷基。
如本文所用，取代的化合物为其中核心结构的一个或者多个氢原子已经被官能团(例如烷基、羟基或者卤素)替代的化合物。取代的苯的实例为甲苯(C6H5-CH3)。
如本文所用，烷基是指直链或者支链的烷烃基(即稳定结构所需的氢原子之一缺失的基团)，(-CnH2n+1)。烷基的实例包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基和十二烷基。“低级烷基”是指包含1个至6个碳的烷基。环烷基是指脂环族烃。环烷基的实例包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基。如本文所用，杂环烷基是指在环中具有非碳元素的环烷基。优选的烷基为低级烷基。
如本文所用，烯基是指衍生自烯烃通过去除乙烯基质子而得的脂肪族烃基，其优选地具有2个至40个碳原子，更优选地具有2个至20个碳原子以及甚至更优选地具有2个至6个碳原子。如本文所用，环烯基是指脂环族烯基。杂环烯基是指在环中具有非碳元素的环烯基。代表性烯基包括乙烯基(-CH＝CH2)和Z-1-丁烯-1-基或者E-1-丁烯-1-基(-CH＝CHCH2CH3)。
本文所用的术语炔基是指衍生自炔烃通过去除炔基质子之一而得的单价基团，其优选地具有2个至40个碳原子，更优选地具有2个至20个碳原子以及甚至更优选地具有2个至6个碳原子。优选的炔基包括乙炔基(-C≡CH)、1-丙炔-1-基(-C≡CCH3)等。
本文所用的术语烯基烷基是指在远离连接点的位置包含至少一个碳-碳双键的烷基。烯基烷基的实例为2-丙烯-1-基(-CH2CH＝CH2，亦称为烯丙基)。
本文所用的术语炔基烷基是指在远离连接点的位置包含至少一个碳-碳三键的烷基。炔基烷基的实例为2-丙炔-1-基(-CH2C≡CH，亦称为炔丙基)。
本文所用的术语芳基是指6个至20个碳原子的取代或未取代的芳香族碳环基团，其具有单一的环(例如，苯基)或者多个稠(稠合的)环，其中至少一个环是芳香族的(例如，萘基、二氢菲基、芴基或者蒽基)。优选的芳基包括苯基、萘基等。
如本文所用，杂芳基是指在5元环或6元环中或者在若干个稠合的5元环或6元环的至少一个中具有非碳元素的芳香族环基团。代表性杂芳基包括吡啶基、噁唑基和噻唑基。
如本文所用，氰基是指具有式-C≡N的基团。
如本文所用的术语卤素是指氟、氯、溴和碘。本发明的实施方案还可以包括二卤素或者三卤素。
如本文所用的“盐”是指保留母体化合物的生物效应和性能并且在施用剂量下在生物学上或者其它方面无害的那些盐。本发明的化合物的盐可以由无机酸或有机酸或者无机碱或有机碱制备。
在另一实施方案中，本发明涉及式I的化合物：
其中R独立地被以下的至少一个取代：-OH、-NH2、-SH、卤素、-CN、-NR1R2、-OR1、-SR1、-S(O)R1、-SO2R1、-C(O)R1、-C(O)NR1R2、-NHC(O)R1、-NHSO2R1、-NHC(O)OR3、-SO2NR1R2或者-NHC(O)NR1R2，其中R1和R2各自独立地为氢或者低级烷基并且R3为低级烷基。
在另一实施方案中，本发明的盐包含无机阳离子或者有机阳离子，所述无机阳离子包括但不限于碱金属阳离子或者碱土金属阳离子，例如Na+、K+、Li+、Mg2+、Ca2+，所述有机阳离子为例如质子化的胺(+NHR4R5R6)或者季铵离子(+NR7R8R9R10)，其中R4、R5和R6各自独立地为氢、低级烷基、芳烷基，R7、R8、R9和R10各自独立地为芳烷基或者低级烷基。
在另一实施方案中，本发明的盐包含选自氯离子(Cl-)、溴离子(Br-)、碘离子(I-)、硫酸根(SO42-)和硫酸氢根(HSO4-)等的无机阴离子，或者选自甲酸根(HCO2-)、乙酸根(CH3CO2-)、酒石酸根(-CO2CH(OH)CH(OH)CO2-)、甲磺酸根(CH3SO3-)和甲苯磺酸根(CH3C6H4SO3-)的有机阴离子，并且其中R必须包含碱性氮原子。
在另一实施方案中，本发明涉及调节植物生长的方法，其包括向需要生长调节的植物或者植物部分应用有效量的本发明的化合物。
在另一实施方案中，本发明涉及制备本发明的化合物的方法，所述方法包括使(S)-ABA与烷化剂反应以形成酯(步骤a)；在溶剂中用碱和甲基化试剂处理从步骤a得到的(S)-ABA酯(步骤b)；以及任选地通过使用酯水解程序水解从步骤b得到的化合物。可以使用本领域的技术人员已知的任何酯水解程序。这些程序包括使用含LiOH、NaOH或者KOH的甲醇水溶液，用任选地与可混溶的有机溶剂组合的水解酶的水溶液进行酶法水解。这种合成例示于以下方案I中。
方案I
本发明的化合物具有广泛的商业应用，包括果实(例如葡萄)着色、稀疏、芽体萌发、种子处理和作物胁迫管理。此外，这些化合物可以在营养和药物领域具有应用性。
所公开的实施方案仅为本文公开的发明构思的示例性实施方案，并且不应被认为是限制性的，除非权利要求另外明确说明。
如本文所用，涉及量、重量百分比等的所有数值都定义为“约”或者“大约”每一具体值，即，加上或者减去10％(±10％)。例如，短语“至少5重量％”应理解为“至少4.5重量％至5.5重量％”。因此，权利要求的范围涵盖在所限定的值10％以内的量。
冠词“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“所述/该(the)”旨在包括复数以及单数，除非上下文另外明确指明。
以下实施例旨在例示本发明并且教导本领域的技术人员如何使用本发明的制剂。它们并不旨在以任何方式进行限制。
实施例
实例1a
(2Z,4E)-甲基5-((S)-1-羟基-2,6,6-三甲基-4-氧代环己-2-烯-1-基)-3-甲基戊-2,4-二烯酸甲酯
将(S)-ABA(53g,0.2摩尔)在乙腈(800ml)中的溶液用冰浴冷却。添加碳酸铯(98g,0.3摩尔)。将混合物搅拌十分钟，然后添加碘代甲烷(24.8ml,56.5g,0.4摩尔)。在环境温度下搅拌过夜后，将混合物浓缩至～300ml并且添加水(500ml)。将所得的混合物用乙酸乙酯(3×200ml)萃取。将所得的有机溶液用饱和亚硫酸钠水溶液洗涤两次，干燥(无水MgSO4)并且过滤。蒸发滤液产生呈灰白色固体状的标题化合物(56g)。1HNMR(CDCl3)：δ7.90(d,1H),6.15(d,1H),5.95(s,1H),5.76(s,1H),3.71(s,3H),2.48(d,1H),2.29(d,1H),2.01(s,3H),1.93(s,3H),1.11(s,3H),1.02(s,3H)。
实例1
(2Z,4E)-甲基5-((S)-1-羟基-2,3,6,6-四甲基-4-氧代环己-2-烯-1-基)-3-甲基戊-2,4-二烯酸甲酯
在氮气气氛下，将实例1a(27.8g,0.1摩尔)在无水四氢呋喃(THF,600ml)中的溶液用冰浴冷却至0℃。在约30分钟内经注射器逐滴添加六甲基二硅氮烷锂(1.0M在THF中溶液,150ml)。将所得的溶液在0℃下搅拌30分钟并且移除冰浴。在20分钟内经注射器添加碘代甲烷(8.09ml,18.4g,0.13摩尔)在无水THF(20ml)中的溶液。将所得的溶液在环境温度下搅拌过夜。将反应用饱和氯化铵水溶液(200ml)和水(200ml)淬灭并且用乙酸乙酯萃取(3×150ml)。将合并的有机溶液进行干燥(MgSO4)、过滤以及浓缩。将残留物在用乙酸乙酯和己烷洗脱的硅胶柱上进行纯化。获得呈白色固体状的标题化合物(17.1g)。1HNMR(CDCl3)：δ7.84(d,1H),6.16(d,1H),5.75(s,1H),3.70(s,3H),2.44(d,1H),2.34(d,1H),2.00(s,3H),1.88(s,3H),1.83(s,3H),1.07(s,3H),1.00(s,3H)。MS(ESI-):m/e＝291。
实例2
(2Z,4E)-5-((S)-1-羟基-2,3,6,6-四甲基-4-氧代环己-2-烯-1-基)-3-甲基戊-2,4-二烯酸(3’-甲基-(S)-脱落酸)
将氢氧化锂一水合物(9.81g,234毫摩尔)添加至实例1(17.1g,58.5毫摩尔)在甲醇(270ml)和水(30ml)中的溶液。将混合物在室温下搅拌48小时，然后蒸发以去除大部分甲醇。添加水(200ml)。将所得的混合物用冰浴冷却并且用6N HCl水溶液酸化至pH 2-3，产生白色沉淀物。将混合物用乙酸乙酯萃取(3×150ml)。将合并的有机溶液进行干燥(MgSO4)、过滤并且蒸发以产生呈白色固体状的标题化合物(16.4g)。可选地，该白色沉淀物可以由酸化的水溶液通过过滤直接获得，用少量水洗涤，并且在真空下干燥以产生标题化合物。1HNMR(CDCl3)：δ7.89(d,1H),6.17(d,1H),5.76(s,1H),2.47(d,1H),2.34(d,1H),2.15(s,1H),2.10(s,3H),1.87(s,3H),1.83(s,3H),1.07(s,3H),1.01(s,3H)。MS(ESI-)：m/e＝277。2D-NMR实验(COSY、NOESY、HSQC、HMBC)确定在3’-位置发生甲基化。在Pirkle Covalent(R,R)-Whelk-01柱上的手性HPLC分析表明该材料为>99％的(S)-异构体。(R)-异构体低于设定在262nm的UV检测器的检测限。
实例3a
(2E,4E)-甲基5-((S)-1-羟基-2,3,6,6-四甲基-4-氧代环己-2-烯-1-基)-3-甲基戊-2,4-二烯酸甲酯
在制备实例1的过程中将该化合物作为副产物进行分离。
实例3
(2E,4E)-5-((S)-1-羟基-2,3,6,6-四甲基-4-氧代环己-2-烯-1-基)-3-甲基戊-2,4-二烯酸
根据实例2的程序制备标题化合物，其中用实例3a代替实例1。1HNMR(CDCl3)：δ6.43(d,1H),6.17(d,1H),5.87(s,1H),2.46(d,1H),2.35(d,1H),2.29(s,3H),2.11(s,1H),1.85(s,3H),1.82(s,3H),1.06(s,3H),100(s,3H)。MS(ESI-)：m/e＝277。2D-NMR实验(COSY、NOESY、HSQC、HMBC)确定在3’-位置发生烷基化。
实例4：用于比较的(±)-3’-甲基ABA
实例4a
(±)-(2Z,4E)-甲基5-(1-羟基-2,6,6-三甲基-4-氧代环己-2-烯-1-基)-3-甲基戊-2,4-二烯酸甲酯
根据实例1a的程序制备标题化合物，其中用(±)-ABA代替(S)-ABA。
实例4b
(±)-(2Z,4E)-甲基5-(1-羟基-2,3,6,6-四甲基-4-氧代环己-2-烯-1-基)-3-甲基戊-2,4-二烯酸甲酯
根据实例1的程序制备标题化合物，其中用实例4a代替实例1a。
实例4
(±)-(2Z,4E)-5-(1-羟基-2,3,6,6-四甲基-4-氧代环己-2-烯-1-基)-3-甲基戊-2,4-二烯酸
根据实例2的程序制备标题化合物，其中用实例4b代替实例1。1HNMR(CDCl3)：δ7.89(d,1H),6.17(d,1H),5.76(s,1H),2.47(d,1H),2.34(d,1H),2.15(s,1H),2.04(s,3H),1.88(s,3H),1.83(s,3H),1.06(s,3H),1.01(s,3H)。MS(ESI-)：m/e＝277。2D-NMR实验(COSY、NOESY、HSQC、HMBC)确定在3’-位置发生甲基化。在具有设定在263nm的UV检测器的Pirkle Covalent(R,R)-Whelk-01柱上的手性HPLC分析表明该材料由49％的(S)-异构体和51％的(R)-异构体组成。
实施例5
种子发芽测定
为了测定类似物的发芽抑制效能，用模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)进行发芽测定。通过在200标准度数(proof)的乙醇中摇振五分钟，然后在10％漂白剂溶液中摇振五分钟对拟南芥种子进行杀菌。然后将种子在无菌的、经蒸馏的去离子水中洗涤五次并且悬浮于0.1％的植物用琼脂(phytoagar)中。将包含种子的管包裹在铝箔中并且在4℃下层积至少两天。
在四孔板中测试类似物。每个板包括这样的孔：每个孔分别含有0.5％DMSO对照、(S)-ABA、(S)-3’-甲基-ABA(实例2)和(±)-3’-甲基-ABA(实例4)，所有的都为所需的浓度。在典型的实验中，将每种化合物在10％DMSO中的100ppm原液吸取18微升移入指定的孔。向每个孔添加另外的DMSO(28.2微升)和水(3.8微升)，然后向所有孔添加5.95mL的包含1.2％Bactoagar的1/2×Murashige和Skoog培养基。这使得每个孔的总体积为6.0mL，测试化合物为0.3ppm以及DMSO的最终浓度为0.5％。当培养基固化时，将一百个无菌层积的拟南芥种子分配入每个孔。将该板用医用胶带进行密封并且置于生长室中，其中在24℃下光照12小时并且在19℃下避光12小时进行昼夜循环。将板在高分辨率(600dpi)下每天进行扫描直到所有种子都发芽。一旦长出胚根就将种子评定为发芽。在图1中报告了种子每天发芽的百分率。各个浓度的测试重复进行至少两次并且结果是可再现的。
如图1所见，相对于(S)-ABA或者外消旋类似物(±)-3’-甲基-ABA(实例4)，(S)-3’-甲基-ABA(实例2)在抑制拟南芥种子发芽方面更有效。对于(S)-ABA处理，100％发芽的时间为6天，对于(±)-3’-甲基-ABA处理则为8天，而对于(S)-3’-甲基-ABA处理则为15天。与(S)-ABA相比，该生物测定表明了(S)-3’-甲基-ABA的整体激动剂的性质。
因此，利用该测定，本申请人出乎意料地发现(S)-3’-甲基-脱落酸比(S)-ABA或者(±)-3’-甲基-ABA更有效。基于Ueno等人的教导(参见上文)，这些结果是出乎意料的。此外，基于(S)-ABA在植物生理学上的已知的功能，这些结果意味着(S)-3’-甲基-脱落酸及其酯在介导气孔关闭以及促进花色素苷的生物合成上比(S)-ABA或者(±)-3’-甲基-ABA更有效。因此，预期该化合物对果实(例如葡萄)着色、稀疏、保护植物免受干旱胁迫或者其他的(S)-ABA的生物效应上更有效。