一种间充质干细胞低温保存液及其制备方法与流程

本发明属于干细胞保存技术领域，特别涉及一种间充质干细胞低温保存液及其制备方法，本发明还涉及由该间充质干细胞低温保存液制得的间充质干细胞注射液及其制备方法。

背景技术：

间充质干细胞[mesenchymalstemcells,msc]是中胚层来源的一类具有多向分化潜能的干细胞，广泛分布于人体多种组织，如骨髓、脂肪、脐带、胎盘、羊膜、羊水、月经血、牙髓和胰腺等。间充质干细胞可以发育成硬骨、软骨、脂肪和其他类型的细胞。间充质干细胞具有支持造血和免疫调节作用，在心血管疾病、肝硬化、神经系统疾病、膝关节半月板部分切除损伤修复、自身免疫性疾病等方面具有长远的发展前景。

间充质干细胞需要在gmp环境下大规模制备，之后运输到医院用于临床治疗。间充质干细胞在gmp环境下处理后，并不能即时输注，过渡期间必需使用可被临床输注的保存液进行运输。目前常用的方法为冻存运输，此方法需要使用冻存保护剂，如二甲基亚砜(dmso)、乙二醇、甲醇、聚合物羟乙基淀粉等。最常用的dmso具有毒性会引起严重的不良反应，如恶心、呕吐、皮疹、腹痛、血压过低、严重神经系统疾病、肾衰竭和心血管疾病，其他的冻存保护剂也会不同程度对细胞造成损伤。因此，寻找一种不含冻存保护剂的方式保存运输细胞，对于间充质干细胞的临床应用具有非常重要的意义。

目前，常用的短期储存干细胞的保存液为m199、磷酸盐缓冲液(pbs)、0.9％生理盐水、5％葡萄糖、含1％人血白蛋白的dmem等。m199和pbs不是临床批准的注射用药品，因此不能作为间充质干细胞的保存液用于临床治疗。dmem为细胞培养基，但是仅用于科研使用，不作为临床使用的试剂。尽管0.9％生理盐水和5％葡萄糖是临床安全的保存液，这两种保存液保存的细胞存活率下降均较快，只适用于间充质干细胞的即时使用，不能用于较长时间(如24h)运输后使用。

技术实现要素：

本发明提供一种间充质干细胞低温保存液，以解决现有技术的上述不足；与现有技术的间充质干细胞保存液相比，本发明不使用具有毒副作用和对细胞造成损伤的冻存保护剂，避免了冻存解冻步骤，极大地提高了临床安全性和简便性，同时延长了干细胞活性维持时间，保证24h运输后细胞活性仍能满足临床使用要求。因此，具有安全性高、便于运输、细胞活性高的优点，使其为间充质干细胞的短期低温保存开辟了道路。

复方电解质注射液在临床上可在输血前或输血后输注，可加入正在输注的血液组分中，或作为血细胞的稀释液。复方电解质注射液可作为水、电解质的补充源和碱化剂。人血白蛋白由健康人血浆经低温乙醇蛋白分离法提取，临床上可增加血容量和维持血浆胶体渗透压、结合阳离子和阴离子以输送不同物质、在氮代谢障碍时作为氮源为组织提供营养。在细胞保存过程中，添加人血白蛋白可以保护细胞减少环境压力和防止细胞贴附于管壁。因此，本发明采取向复方电解质注射液中加入人血白蛋白注射液，作为保存液来保存间充质干细胞，较好地避免了使用冻存保护剂的毒性问题，避免了冻存解冻步骤，极大地提高了临床安全性和简便性，且保证了24h运输后细胞活性仍满足临床使用要求，具有非常好的应用前景。

本发明的技术方案如下：

一种间充质干细胞低温保存液，由体积比为1:100～1:5的人血白蛋白注射液和复方电解质注射液组成；所述的人血白蛋白注射液为含人血白蛋白5g/25ml的注射液；所述的复方电解质注射液为每1000ml含氯化钠5.26g、葡萄糖酸钠5.02g、醋酸钠3.68g、氯化钾0.37g和氯化镁0.30g组成。

本发明还公开了上述的间充质干细胞低温保存液的制备方法，将所述的人血白蛋白注射液加入到所述的复方电解质注射液中，混合均匀，即制得所述的低温保存液。

本发明还公开了上述的间充质干细胞低温保存液制备的间充质干细胞注射液，所述的间充质干细胞低温保存液中含有浓度为8×10⁵个/ml～2×10⁷个/ml的间充质干细胞。

优选为，所述的间充质干细胞为人间充质干细胞。

本发明还公开了上述的间充质干细胞注射液的制备方法，至细胞浓度为8×10⁵个/ml～2×10⁷个/ml，向所述的间充质干细胞低温保存液加入间充质干细胞，制成单细胞悬液，即制得所述的间充质干细胞细胞注射液。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

由本发明的一种间充质干细胞低温保存液制得的间充质干细胞注射液，通过使用人血白蛋白注射液和复方电解质注射液制得的低温保存液保存人间充质干细胞，避免了使用具有毒副作用和对细胞造成损伤的冻存保护剂，且避免了冻存解冻步骤，极大地提高了临床安全性和简便性，同时延长了干细胞活性维持时间，保证24h运输后细胞活性仍能满足临床使用要求，具有安全性高、便于运输、细胞活性高、成本低廉的优点。

当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。

附图说明

图1为不同保存液低温保存运输人间充质干细胞24h后的细胞活率对比图；

图2为不同保存液低温保存运输人间充质干细胞24h后的贴壁对比图；

图3为不同保存液低温保存运输人间充质干细胞24h后的克隆形成对比图；

图4为本发明的低温保存液保存运输人间充质干细胞24h后的增殖能力趋势图；

图5为本发明的低温保存液保存运输人间充质干细胞24h后的细胞成骨分化能力图；

图6为本发明的低温保存液保存运输人间充质干细胞24h后的细胞成脂分化能力图；

图7为本发明的低温保存液保存运输人间充质干细胞24h后的表面hla-dr、cd34、cd45、cd73、cd90和cd105检测结果示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应该理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限定本发明的保护范围。在实际应用中本领域技术人员根据本发明做出的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

一、主要仪器及试剂：

仪器：co2培养箱、离心机、流式细胞仪、细胞计数仪、倒置相差显微镜、酶标仪、荧光定量pcr仪、高效液相均是实验室所具备和使用的常规仪器，可在市场上购买。；

试剂：复方电解质注射液购买于四川科伦药业股份有限公司，人血白蛋白购买于上海生物制品研究所有限公司，胎牛血清、α-mem培养基、消化用tryple、台盼蓝、凋亡试剂盒、alamarblue试剂盒、成骨分化试剂盒、成脂分化试剂盒、茜素红、油红o和表面标记抗体也均直接在市场上购买。

二、实施例

实施例1：由本发明的一种间充质干细胞低温保存液制得的间充质干细胞注射液与其他配方制得的注射液进行细胞活率、贴壁情况和克隆形成情况的比较

1.1制备本发明间充质干细胞注射液和他配方注射液

各不同保存液的配方、保存温度和保存时间，如表1所示。

unstored组为对照组，即10％胎牛血清(fbs)加入到α-mem中制得保存液，然后将新鲜消化的细胞悬浮于该保存液，至细胞密度1×106cells/ml，不进行保存操作，直接进行实验。

复方电解质注射液(me)+人血清白蛋白(hsa)组为本发明的间充质干细胞注射液，即5％hsa加入到复方电解质注射液中制得保存液，然后将新鲜消化的细胞悬浮于该保存液，至细胞密度1×10⁶cells/ml，保存24h后进行实验。

生理盐水注射液(ns)+hsa组为由5％hsa加入到生理盐水中制得的保存液，然后将新鲜消化的细胞悬浮于该保存液，至细胞密度1×10⁶cells/ml，保存24h后进行实验。

葡萄糖(glucose)组为购得的5％葡萄糖作为保存液，将新鲜消化的细胞悬浮于该保存液，至细胞密度1×10⁶cells/ml，保存24h后进行实验。

gm组为将10％fbs加入到α-mem中制得保存液，然后将新鲜消化的细胞悬浮于该保存液，至细胞密度1×10⁶cells/ml，保存24h后进行实验。

表1本发明的间充质干细胞注射液与其他配方注射液

1.2本发明的间充质干细胞注射液与其他配方注射液的各项性能检测方法

(1)细胞活率检测

取上述不同配方的注射液，测试细胞活率，检测方法为台盼蓝经典染色法。

(2)贴壁测试

取上述不同配方的注射液，接种细胞在100mm细胞培养皿上，细胞接种密度为1×10⁶个/皿。接种24h后，于显微镜下观察细胞形态并拍照。

(3)克隆形成实验

取上述不同配方的注射液，接种细胞在60mm皿上，细胞接种密度为250个/皿。每3天更换新鲜培养基。接种10～14天后，至显微镜下出现较多明显克隆，结晶紫染色，于显微镜下数克隆数。每个克隆细胞数应大于50个。克隆形成率％＝克隆数/接种细胞数×100％。

1.3本发明的间充质干细胞注射液与其他配方注射液的各项性能检测结果

(1)细胞活率结果

如图1所示，me+hsa组，ns+hsa组细胞活率明显高于葡萄糖组。由于葡萄糖组细胞死亡较多，不适合作为保存液。gm组结团率很高，显著大于其他组。gm组结团率太高，临床使用会给病人带来严重不良反应，不适合作为保存液。

(2)贴壁测试

如图2所示，me+hsa的细胞贴壁形态较好，较接近于对照组unstored组，ns+hsa的贴壁细胞明显减少，说明经过ns+hsa运输后细胞贴壁性能下降明显。

(3)克隆形成实验

如图3所示，所有组都能形成克隆，但是me+hsa组的克隆形成能力明显高于ns+hsa，所以，ns+hsa不适合用作保存液。

通过以上结果看出，本发明的低温保存液me+hsa适合用于间充质干细胞的低温保存。

实施例2：由本发明的一种间充质干细胞低温保存液制得的间充质干细胞注射液进行增殖能力检测、细胞成骨分化能力测试、细胞成脂分化能力测试和细胞表面标记检测。

2.1制备本发明间充质干细胞注射液

将5％hsa加入到复方电解质注射液中制得保存液，然后将新鲜消化的细胞悬浮于该保存液中，至细胞密度5×10⁶个/ml，保存24h后进行实验。

unstored组即为上述的unstored组，是细胞制备结束后，消化得到的新鲜细胞，不经历低温保存。unstored组为对照组，象征细胞最佳的状态。设置该组是为了检验经过我们低温保存后，细胞的状态是否发生显著性改变，如细胞活率是否显著降低等。

本发明的间充质干细胞注射液的各项性能检测方法

(1)增殖能力检测

取本发明的间充质干细胞注射液，接种细胞在24孔板上，细胞接种密度为2×10⁴个/孔。接种24h后，将培养基更换为含10％alamarblue的培养基，37℃的co2培养箱中孵育3h后，测定荧光值，波长为570nm和590nm。

(2)细胞成骨分化能力测试

取本发明的间充质干细胞注射液，接种细胞在12孔板上，细胞接种密度为5×10³个/孔。每3天更换新鲜培养基。至细胞长至约80％融合时，更换培养基为成骨诱导培养基，每3天更换成骨诱导培养基，21天时用茜素红染色，显微镜下观察并拍照。对照组为正常培养基组，不添加成骨诱导培养基。

(3)细胞成脂分化能力测试

取本发明的间充质干细胞注射液，接种细胞在12孔板上，细胞接种密度为1×10⁴个/孔。每3天更换新鲜培养基。至细胞长至约80％融合时，更换培养基为成脂诱导培养基，每3天更换成脂诱导培养基，21天时用油红o染色，显微镜下观察并拍照。对照组为正常培养基组，不添加成脂诱导培养基。

(4)细胞表面标记检测

取本发明的间充质干细胞注射液，1000rpm离心5min后，用pbs清洗两次，用含2％胎牛血清的pbs重悬细胞，加入抗体孵育30min后，用流式细胞仪检测。

2.3本发明的间充质干细胞注射液的各项性能检测结果

(1)增殖检测结果

如图4所示，间充质干细胞经过本发明的间充质干细胞保存液低温保存24h后，细胞经过短暂的停滞后迅速增殖，于第9天达到峰值。

(2)成骨分化结果

如图5所示，间充质干细胞经过本发明的间充质干细胞保存液低温保存24h后，细胞依然具有成骨分化能力，和不诱导的对照组相比，有明显的钙结节。

(3)成脂分化结果

如图6所示，间充质干细胞经过本发明的间充质干细胞保存液低温保存24h后，细胞仍然具有成脂分化的能力，和不诱导的对照组相比，有明显的油滴。

(4)细胞表面标记检测结果

如图7所示，间充质干细胞经过本发明的间充质干细胞保存液低温保存24h后，细胞表面标记hla-dr、cd34、cd45依然为阴性表达(＜2％)，cd73、cd90、cd105依然为阳性表达(＞95％)，保存后表面标记未发生明显改变。

以上结果表明，经过本发明的间充质干细胞保存液低温保存24h后的间充质干细胞，细胞仍然具有较高的增殖潜能、成骨和成脂分化能力，及细胞表面标记未发生显著性改变。

综上，本发明的间充质干细胞低温保存液可以在24h内维持较高的细胞活率、较好的贴壁能力、较好的克隆形成能力。同时，保存后的间充质干细胞仍然具有较高的增殖潜能、成骨成脂分化能力，细胞表面标记未明显降低。本发明的间充质干细胞低温保存液不含有毒副作用和对细胞造成损伤的冻存保护剂，不需要冻存解冻步骤，使用临床安全可靠的保存液，方便快捷、安全可靠、成本低廉、细胞活率高、细胞免疫功能高，具有非常好的应用前景。

以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。