嘧菌酯纳米微球的制备方法与流程

本发明涉及一种制备纳米嘧菌酯超分子自组装微球(p-mjz)的方法，所制备的纳米微球具有缓释等优点。

背景技术：

我国是农业大国，农药是防御重大生物灾害、保障国家粮食安全的重要物质基础。但传统的农药剂型在喷施时会因风吹、日晒、雨淋而损失比例高达50-60％，农药的光解、水解、生物降解、挥发和流失等问题严重，利用率普遍偏低，一般只有20-30％，持效期较短，因此农药的大量施用和残留不仅加剧了农产品污染和对人类健康的威胁，也对生态系统的结构和功能产生了严重破坏。因此，提高农药利用率，增加农药使用安全性，延长农药持效期等受到研究者的广泛关注。

利用纳米技术或纳米材料来改善传统农药的粒径、剂型、功能，提高农药的有效性与安全性、突破制约农药剂型创制理论与方法发展的瓶颈问题，揭示纳米材料与技术改善农药剂型功能的作用机制，发展高效、安全与低成本的新型纳米农药，是当前国内外研究热点。

将纳米技术与农药的研制相结合，即形成了一个新兴的纳米农药研究领域。通常所获得的颗粒粒径小于1000纳米的，即称为纳米农药。纳米农药不仅大大降低了用药量，提高了药效，在使用经济性上也得到突破。真正体现了使用浓度低、防治谱广、病虫草害不易产生抗性、对人畜低毒、农药残留少、对环境污染小等诸多优点。

嘧菌酯((e)-[2-[6-(2-氰基苯氧基)嘧啶-4-基氧]苯基]-3-甲氧基丙烯酸甲酯)是甲氧基丙烯酸醋类杀菌剂，具有杀菌谱广、活性高以及良好的毒理和环境特性，对环境和非靶标作物无害，与目前已有其他类别杀菌剂无交互抗性，已广泛应用于谷物、果蔬等的病害防治与贮藏保鲜，市场需求旺盛。其有效成分易水光解，目前市场上以水悬浮剂(sc)和水分散粒剂(wg)为主，存在有效利用率低，持效期短等问题。

超分子化学是基于分子间的弱相互作用(如氢键、范德华力、偶极-偶极相互作用、亲水-疏水相互作用、π-π堆积、金属配位键以及它们之间的协同作用)而形成的复杂有序且具有特定功能的分子聚集体的化学，它不同于基于原子构建分子的传统分子化学，而是分子以上层次的化学。它主要研究由两个或两个以上分子通过分子之间的非共价键弱相互作用(或称次级键)而生成的分子聚集体及结构和功能的化学。超分子化学用于控释医药是目前研究的热点，在农药上的应用还比较少见。

超分子聚合物是指重复单元经可逆和具方向性的非共价相互作用连接成的聚合物。由于其动态的性质，超分子聚合物可以用来制备易加工、易降解、环境响应与自修复的聚合物材料。柠檬酸/聚乙二醇的聚合物是树状状嵌段聚合物，由聚柠檬酸(pca)和聚乙二醇(peg)组成的aba型三嵌段共聚物，a是指具有亲水性的树状分支聚柠檬酸(pca)，b是指具有亲水性的线性聚乙二醇(peg)其分子两端的树状分支柠檬酸中含有大量羧基，可以形成氢键，同时其分子中间的线性聚柠檬酸具有很好的柔韧性可自由摆动，这些结构决定其在溶液中可以发生超分子自组装形成纳米微球，柠檬酸/聚乙二醇的嵌段树枝状聚合物(简称p)可以与活性分子自组装，形成具备不同形状的复杂的超分子共聚体。柠檬酸/聚乙二醇的嵌段树枝状聚合物与药物分子作用的原理如图1所示。

目前制备柠檬酸/聚乙二醇的嵌段树枝状聚合物的方法有多种，其中常见的是使用二酰氯聚乙二醇与柠檬酸酸反应制备，该方法步骤繁琐，需要多次对中间产物进行纯化处理，且需要使用氯化亚砜、吡啶等有毒试剂。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种嘧菌酯纳米微球的制备方法，本发明解决了传统农药制剂存在的利用率低、持效期短等问题，本发明采用绿色安全的柠檬酸/聚乙二醇的嵌段树枝状聚合物体系作为载体控制农药释放速度，延长持效期，减少农药使用量。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种嘧菌酯纳米微球的制备方法：

把嘧菌酯原药溶于有机溶剂a中，得溶液ⅰ；

把柠檬酸/聚乙二醇的嵌段树枝状聚合物溶于有机溶剂b中，得溶液ⅱ；

按照嘧菌酯原药：柠檬酸/聚乙二醇的嵌段树枝状聚合物＝1:1的重量比，将溶液ⅰ和溶液ⅱ混合反应，室温下搅拌6-12h，然后减压浓缩(除去反应溶剂)，装入透析袋中，在混合溶剂中透析24±2h(从而除去反应不完全的嘧菌酯)，得到的油状物为嘧菌酯纳米微球(即，纳米嘧菌酯超分子自组装微球，淡黄色，粒径在10-1000纳米)。

作为本发明的嘧菌酯纳米微球的制备方法的改进：

有机溶剂a为丙酮、甲醇、乙醇、异丙醇、异丁醇、乙酸乙酯；

有机溶剂b为异丁醇、甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、异丙醇(均属于易溶于水的剂型溶剂)。

作为本发明的嘧菌酯纳米微球的制备方法的进一步改进：所述混合溶剂由体积含量10％～90％(优选为50％)的有机溶剂a和作为余量的有机溶剂b组成。

作为本发明的嘧菌酯纳米微球的制备方法的进一步改进：所述混合溶剂为乙醇：丙酮＝50:50，v/v。

作为本发明的嘧菌酯纳米微球的制备方法的进一步改进：

所述透析袋的透析分子量1000-3000(cutof1000-3000，优选2000)；

嘧菌酯原药与有机溶剂a的料液比为1g:40～60ml；

柠檬酸/聚乙二醇的嵌段树枝状聚合物与有机溶剂b的料液比为1g:40～60ml；

减压浓缩直至为原体积的1/10～1/4。

作为本发明的嘧菌酯纳米微球的制备方法的进一步改进：柠檬酸/聚乙二醇的嵌段树枝状聚合物的制备方法为包括以下步骤：

1)、把无水柠檬酸(ca)和聚乙二醇(peg，mn＝1000-10000，优选为1000)按照1～10:1的摩尔比(较佳为10:1)混合，所得的反应体系于真空除水条件下升温至100-160℃下搅拌反应20-90分钟；

2)、步骤1)的产物冷却至室温后溶解于去离子水，使用透析分子量1000-3000(较佳为2000)透析袋于去离子水中透析24±2小时(目的是为了除去未聚合的反应原料)，得柠檬酸/聚乙二醇的嵌段树枝状聚合物。

说明：聚合度低的柠檬酸/聚乙二醇的嵌段树枝状聚合物是无色粘稠的，而聚合度高的柠檬酸/聚乙二醇的嵌段树枝状聚合物为白色的和无定形的。

作为本发明的嘧菌酯纳米微球的制备方法的进一步改进：步骤1)的产物与去离子水的料液比为1g/3～5ml(1g/4ml)。

作为本发明的嘧菌酯纳米微球的制备方法的进一步改进，步骤1)中：

先将反应体系升温至100～120℃搅拌30±5分钟(使体系透明粘胶化)；

然后，将温度升高至130～140℃(使混合物处于熔融状态)，保温搅拌25±5分钟，反应生成的水以水蒸气的形式被排出(从而促进反应进行)；

接着，温度继续升到150～160℃在1400±200r/min的高速搅拌下进行聚合反应30±5分钟，反应生成的水以水蒸气的形式被排出。

作为本发明的嘧菌酯纳米微球的制备方法的进一步改进：步骤2)中：

透析结束后，将透析袋中残留的液体减压(60℃，-0.097mpa)除水2±0.5h，得柠檬酸/聚乙二醇的嵌段树枝状聚合物。

在本发明中，没有特定给出转速的搅拌为常规搅拌。

在本发明所涉及的柠檬酸/聚乙二醇的嵌段树枝状聚合物制备方法中：反应仅使用柠檬酸和聚乙二醇这两种绿色无污染的原料，避免了常规方法使用氯化亚砜、吡啶等有毒试剂。反应使用真空除水的方式促进反应发生，仅需一步即可完成全部反应。反应产物采用透析的方式进行纯化，仅需透析一次，即可得到产物柠檬酸/聚乙二醇的嵌段树枝状聚合物。操作简便，无有害物质排放，绿色无污染。

本发明提供了一种粒径在50～100nm的嘧菌酯纳米微球的制备方法，该方法使用柠檬酸、聚乙二醇制备树状嵌段聚合物作为载体，利用超分子化学非共价键络合的方式包被嘧菌酯，形成嘧菌酯纳米微球(p-mjz)。该纳米嘧菌酯微球具有延长持效期的作用。

本发明中，檬酸和聚乙二醇均为只含有c、h、o绿色原子的环保材料。采用本发明方法制备而得的嘧菌酯纳米微球(p-mjz)可配制成悬浮剂、水分散可粒径等，防治农作物病原真菌，具有一定的增效、缓释作用，持续期延长。

本发明具有如下技术优势：

1)、材料环保无污染：本发明所制备的柠檬酸/聚乙二醇的嵌段树枝状聚合物，所使用的原料柠檬酸和聚乙二醇廉价易得无毒无害；制备柠檬酸/聚乙二醇的嵌段树枝状聚合物的合成工艺简单、无有害物质排放；环境相容性高，绿色无污染的特点。

2)、工艺简单易行：本发明制备纳米嘧菌酯微球的工艺操作简单，无有害物质排放，经济环保；所制备的纳米嘧菌酯微球心态稳定，负载率较高。

3)、延长持效期：本发明所制备的嘧菌酯纳米微球作为缓释剂能够降低环境中光、空气、水和微生物对活性成分的分解，并且能够通过其释放机制的不同达到控制释放或缓慢释放的目的，使其具有明显的缓释性能，可大大的延长活性成分的释放时间，延长持效期。

4)、将高毒农药低毒化，减少对非靶标标生物的毒性：本发明所制备的嘧菌酯纳米微球，其活性成分包裹在聚合物中，实现其在使用中缓慢释放，避免了很多农药对人畜或蜂、鸟、鱼、蚕高毒，在使用时很容易对周围非靶标生物造成危害。从而大大减小其毒性。

5)、提高对靶标沉积性：本发明所制备的嘧菌酯纳米微球，以粘稠胶状物的形式存在，将容易在起作用的靶标位点沉积，增加药效，减少了有效成分的损失。由于植物叶片表面以及昆虫体表多为疏水表面，施用后到达靶标的农药易滑落，其不能在植物或昆虫的体表很好的吸附，此外，喷雾飘移、雨水淋溶等情况，会造成大部分农药最终进入土壤，被土壤吸附或被微生物降解，造成农药的浪费。本发明所制备的嘧菌酯纳米微球胶囊，以粘稠胶状物的形式存在，将容易在起作用的靶标位点沉积，增加药效，减少了有效成分的损失。

6)、减少药物的浪费：本发明所制备的嘧菌酯纳米微球将有效成分嘧菌酯用高分子材料包裹固定起来，使农药有效成分可以与周围环境进行隔绝，避免光解、水解、挥发、淋溶以及微生物降解等环境因素，则可有效提高农药有效成分的稳定性，从而增加其持效期，减少农药的浪费。

7)、提髙施用农药的环境相容性：本发明所制备的嘧菌酯纳米微球，使用的壁材为柠檬酸/聚乙二醇体系，对环境无毒无污染，同时避免了常规乳油制剂使用的大量有机溶剂，减少浪费和对环境的污染。

8)、减少或避免药害的发生：本发明所制备的嘧菌酯纳米微球，缓慢释放，不会在同一时间释放所有的有效成分从而可以避免农作物药害的发生；常规农药其释放是开放体系，几乎是同一时间全部释放，施药后会直接接触农作物，因此依靠加大其农药的使用量来达到好的防效，往往会造成药害。

9)易于储存、运输：本发明所制备的嘧菌酯纳米微球可以将其加工成微球固体制剂，可以方便其储存。在我国，传统农药剂型乳油在农药制剂产品中所占的比例依然很大，其加工过程中使用大量的有机溶剂。大量有机溶剂的存在，会带来储存、运输中易燃、易爆等风险。此外，很多农药的常规剂型是乳油、微乳剂、水乳剂等液体剂型。在运输中存在储运困难，成本高等问题。

综上所述，本发明提供了一种使用绿色环保无污染的柠檬酸/聚乙二醇体系，制备嘧菌酯超分子自组装纳米微球的方法。该方法将柠檬酸与聚乙二醇以一定摩尔比相混合，搅拌均匀后通过高温减压脱水的方式制备出嵌段树枝状聚合物p，所制备的聚合物具有水溶性高、可溶于实验室常见有机溶剂、绿色环保、生物相容性高等特点。将所制备的聚合物与嘧菌酯通过自组装的方式制备得到纳米嘧菌酯超分子自组装微球，使用扫描电镜和粒度分析仪表征其粒度，使用液相色谱法分析所制备的纳米嘧菌酯微球的含药量(负载率)。该方法具有工艺简单，无有害物质排放，经济效益高等特点。所制备的纳米嘧菌酯微球具有杀菌活性高，持效期长等特点，可减少农药使用量，减少对环境的破坏，提高经济效益，在农业生产上应用前景良好。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为柠檬酸/聚乙二醇的嵌段树枝状聚合物与药物结合方式示意图，

图2是实施例1的ca：peg＝10:1聚合物的¹hnmr谱图；

图3是实施例1的p-mjz(ca：peg＝10:1)的¹hnmr谱图；

图4是嘧菌酯标样液相图；

图5是实施例1的p-mjz液相谱图；

图6是纳米嘧菌酯马尔文粒径分布图(柠檬酸/聚乙二醇投料比10:1时)；

图7是实施例1的p-mjz扫描电镜图像；

图8是实施例1的p-mjz在不同ph值环境下的释放率；

图9是实施例1的p-mjz在不同ph值环境下的累积释放率；

图10是实施例1的p-mjz对稻瘟病的抑制效果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：

a)、柠檬酸/聚乙二醇的嵌段树枝状聚合物的制备

将38.42g柠檬酸(0.2mol)和20g聚乙二醇(mn＝1000)(0.02mol)(摩尔比为10:1)安置在装有气体进口、一个真空入口、机械搅拌器和滴液漏斗的安瓿瓶中，将其固定在一个温度可控的油浴中。

于密封条件下先将安瓿瓶的温度升高至120℃，将混合物在此温度下以400r/min搅拌30分钟，使体系透明粘胶化。

然后，将温度升高至140℃，此时混合物处于熔融状态，保温搅拌25分钟，然后真空阀缓慢打开，将反应生成的水以水蒸气的形成从体系中抽出，促进反应进行。

温度继续升到160℃，将混合物在该温度下以1400r/min的转速搅拌30分钟进行聚合反应，期间持续对体系抽真空，以除去反应生成的水。30min后，关闭真空阀，向安瓿瓶中充入氮气，防止聚合物在高温状态下被空气氧化，停止加热，体系在室温下自然冷却，冷却至室温后向安瓿瓶中按照1g/4ml的料液比加入去离子水，搅拌使生成的聚合物溶解在水中，然后将聚合物的水溶液置于透析袋(cutof2000)中，使用去离子水透析24h，未聚合的反应原料和分子量在2000以下的产物被透析除去，透析袋中残留液体的即为柠檬酸/聚乙二醇的嵌段树枝状聚合物，透析结束后，将透析袋中残留的液体减压(60℃，-0.097mpa)除水2h，得到的黄色油状物即为柠檬酸/聚乙二醇的嵌段树枝状聚合物。

结构表征：

通过核磁共振氢谱(¹hnmr)分析，如图2所示，聚乙二醇(peg)中亚甲基上的氢出现在4.7ppm和3.6ppm，peg中末端亚甲基出现在4.4和4.2ppm，柠檬酸(pca)上亚甲基氢出现在2.6-2.9ppm，未结合的羟基出现在3.65ppm。¹hnmr谱图标明，pca-peg-pca聚合反应已经发生，所得聚合物结构正确。

b)超分子自组装纳米嘧菌酯微球

将上述所制备的柠檬酸/聚乙二醇摩尔比等于10:1的聚合物2g溶于100ml异丙醇中，将2g98％嘧菌酯原药溶于100ml乙酸乙酯中；将二者相混合，室温下搅拌8h，然后浓缩(50℃，-0.097mpa，浓缩直至为原体积的1/10)，将浓缩后得到的液体装入rc透析袋中(cutof2000)置于100ml乙醇：丙酮＝50:50(v/v)的透析液中，室温下透析24小时，中途更换透析液3次。未聚合的嘧菌酯分子量低于2000，从透析袋中流出，透析结束后透析袋中所得的黄色油状物即为制备的纳米嘧菌酯超分子自组装微球p-mjz。

¹hnmr谱图解析：如图3所示，6.5-8.4ppm之间为嘧菌酯中苯环和嘧啶环上的氢，3.8为嘧菌酯中两个甲基上的氢。聚乙二醇中亚甲基上的氢出现在4.7ppm和3.6ppm，柠檬酸上亚甲基氢出现2.6-2.8ppm，聚柠檬酸中未结合的羟基的氢出现在3.65。图谱中同时存在树枝状嵌段聚合物和嘧菌酯的特征氢的峰，说明嘧菌酯已成功与柠檬酸/聚乙二醇的嵌段树枝状聚合物通过超分子自组装为超分子共聚体。

实施例2：

a)柠檬酸/聚乙二醇的嵌段树枝状聚合物的制备

将30.75g柠檬酸(0.16mol)和20g聚乙二醇(mn＝1000)(0.02mol)(摩尔比为8:1)安置在装有气体进口，一个真空口，机械搅拌器和滴液漏斗的安瓿瓶中，将其固定在一个温度可控的油浴中。

于密封条件下先将安瓿瓶的温度升高至120℃，将混合物在此温度下以400r/min速度搅拌30分钟，使体系透明粘胶化。

然后，将温度升高至140℃，此时混合物处于熔融状态，保温搅拌25分钟，然后缓慢打开真空阀，将反应生成的水以水蒸气的形成从体系中抽出，促进反应进行。

温度继续升到160℃，将混合物在该温度下以1400r/min的转速搅拌30分钟进行聚合反应，期间持续对体系抽真空，以除去反应生成的水。30min后，关闭真空阀，向安瓿瓶中充入氮气，防止聚合物在高温状态下被空气氧化，停止加热，体系在室温下自然冷却，冷却至室温后向安瓿瓶中按照1g/4ml的料液比加入去离子水，搅拌使生成的聚合物溶解在水中，然后将聚合物的水溶液置于透析袋(cutof2000)中，使用去离子水透析24h，未聚合的反应原料和分子量在2000以下的产物被透析除去，透析带中残留液体的即为柠檬酸/聚乙二醇的嵌段树枝状聚合物，透析结束后，将透析袋中残留的液体减压(60℃，-0.097mpa)除水2h，得到的黄色油状物即为柠檬酸/聚乙二醇的嵌段树枝状聚合物。

b)超分子自组装纳米嘧菌酯微球

将上述所制备的柠檬酸/聚乙二醇摩尔比等于8:1的pca-peg-pca的聚合物2g溶于100ml无水甲醇中，将2g98％嘧菌酯原药溶于100ml丙酮中，将二者相混合，室温下搅拌8h，后将体系减压浓缩至50ml，装入rc透析袋中(cutof2000)中置于丙酮/无水乙醇＝50:50(v/v)的透析液中，室温下透析24小时，中途更换透析液3次。透析结束后透析袋中所得的黄色油状物即为制备的纳米嘧菌酯超分子自组装微球p-mjz。

实施例3

a)柠檬酸/聚乙二醇的嵌段树枝状聚合物的制备

将23.06柠檬酸(0.12mol)和20g聚乙二醇(mn＝1000)(0.02mol)(摩尔比为6:1)安置在装有气体进口，一个真空口，机械搅拌器和滴液漏斗的安瓿瓶中，将其固定在一个温度可控的油浴中。

于密封条件下先将安瓿瓶的温度升高至110℃，将混合物在此温度下以400r/min搅拌30分钟，使体系透明粘胶化。

然后，将温度升高至130℃，此时混合物处于熔融状态，保温搅拌25分钟，然后真空阀缓慢打开，将反应生成的水以水蒸气的形成从体系中抽出，促进反应进行。

温度继续升到150℃，将混合物在该温度下以1400r/min的转速搅拌30分钟进行聚合反应，期间持续对体系抽真空，以除去反应生成的水。30min后，关闭真空阀，向安瓿瓶中充入氮气，防止聚合物在高温状态下被空气氧化，停止加热，体系在室温下自然冷却，冷却至室温后向安瓿瓶中按照1g/4ml的料液比加入去离子水，搅拌使生成的聚合物溶解在水中，然后将聚合物的水溶液置于透析袋(cutof2000)中，使用去离子水透析24h，未聚合的反应原料和分子量在2000以下的产物被透析除去，透析带中残留液体的即为柠檬酸/聚乙二醇的嵌段树枝状聚合物，透析结束后，将透析袋中残留的液体减压(60℃，-0.097mpa)除水2h，得到的黄色油状物即为柠檬酸/聚乙二醇的嵌段树枝状聚合物。

b)超分子自组装纳米嘧菌酯微球

将上述所制备的柠檬酸/聚乙二醇摩尔比等于6:1的pca-peg-pca的聚合物2g溶于100ml无水甲醇中，将2g98％嘧菌酯原药溶于100ml丙酮中，将二者相混合，室温下搅拌8h，后将体系减压浓缩至50ml，装入rc透析袋中(cutof2000)中置于100ml乙醇：丙酮＝50:50(v/v)的透析液中，室温下透析24小时，中途更换透析液3次。透析结束后透析袋中所得的黄色油状物即为制备的纳米嘧菌酯超分子自组装微球p-mjz。

实施例4

a)柠檬酸/聚乙二醇的嵌段树枝状聚合物的制备

将15.37柠檬酸(0.08mol)和20g聚乙二醇(mn＝1000)(0.02mol)(摩尔比为4:1)安置在装有气体进口，一个真空口，机械搅拌器和滴液漏斗的安瓿瓶中，将其固定在一个温度可控的油浴中。

于密封条件下先将安瓿瓶的温度升高至110℃，将混合物在此温度下以400r/min搅拌30分钟，使体系透明粘胶化。

然后，将温度升高至130℃，此时混合物处于熔融状态，保温搅拌25分钟，然后真空阀缓慢打开，将反应生成的水以水蒸气的形成从体系中抽出，促进反应进行。

温度继续升到150℃，将混合物在该温度下以1400r/min的转速搅拌30分钟进行聚合反应，期间持续对体系抽真空，以除去反应生成的水。30min后，关闭真空阀，向安瓿瓶中充入氮气，防止聚合物在高温状态下被空气氧化，停止加热，体系在室温下自然冷却，冷却至室温后向安瓿瓶中按照1g/4ml的料液比加入去离子水，搅拌使生成的聚合物溶解在水中，然后将聚合物的水溶液置于透析袋(cutof2000)中，使用去离子水透析24h，未聚合的反应原料和分子量在2000以下的产物被透析除去，透析带中残留液体的即为柠檬酸/聚乙二醇的嵌段树枝状聚合物，透析结束后，将透析袋中残留的液体减压(60℃，-0.097mpa)除水2h，得到的黄色油状物即为柠檬酸/聚乙二醇的嵌段树枝状聚合物。

b)超分子自组装纳米嘧菌酯微球

将上述所制备的柠檬酸/聚乙二醇摩尔比等于4:1的pca-peg-pca的聚合物2g溶于100ml无水甲醇中，将2g98％嘧菌酯原药溶于100ml丙酮中，将二者相混合，室温下搅拌8h，后将体系减压蒸馏至50ml，装入rc透析袋中(cutof2000)中置于100ml乙醇：丙酮＝50:50(v/v)的透析液中，室温下透析24小时，中途更换透析液3次。透析结束后透析袋中所得的黄色油状物即为制备的纳米嘧菌酯超分子自组装微球p-mjz。

实施例5

a)柠檬酸/聚乙二醇的嵌段树枝状聚合物的制备

将7.69柠檬酸(0.04mol)和20g聚乙二醇(mn＝1000)(0.02mol)(摩尔比为2:1)安置在装有气体进口，一个真空口，机械搅拌器和滴液漏斗的安瓿瓶中，将其固定在一个温度可控的油浴中。

于密封条件下先将安瓿瓶的温度升高至120℃，将混合物在此温度下以400r/min搅拌30分钟，使体系透明粘胶化。

然后，将温度升高至140℃，此时混合物处于熔融状态，保温搅拌25分钟，然后真空阀缓慢打开，将反应生成的水以水蒸气的形成从体系中抽出，促进反应进行。

温度继续升到160℃，将混合物在该温度下以1400r/min搅拌30分钟进行聚合反应，期间持续对体系抽真空，以除去反应生成的水。30min后，关闭真空阀，向安瓿瓶中充入氮气，防止聚合物在高温状态下被空气氧化，停止加热，体系在室温下自然冷却，冷却至室温后向安瓿瓶中按照1g/4ml的料液比加入去离子水，搅拌使生成的聚合物溶解在水中，然后将聚合物的水溶液置于透析袋(cutof2000)中，使用去离子水透析24h，未聚合的反应原料和分子量在2000以下的产物被透析除去，透析带中残留液体的即为柠檬酸/聚乙二醇的嵌段树枝状聚合物，透析结束后，将透析袋中残留的液体减压(60℃，-0.097mpa)除水2h，得到的黄色油状物即为柠檬酸/聚乙二醇的嵌段树枝状聚合物。

b)超分子自组装纳米嘧菌酯微球

将上述所制备的柠檬酸/聚乙二醇摩尔比等于2:1的pca-peg-pca的聚合物2g溶于100ml无水甲醇中，将2g98％嘧菌酯原药溶于100ml丙酮中，将二者相混合，室温下搅拌8h，后将体系减压蒸馏至50ml，装入rc透析袋中(cutof2000)中置于100ml乙醇：丙酮＝50:50(v/v)的透析液中，室温下透析24小时，中途更换透析液3次。透析结束后透析袋中所得的黄色油状物即为制备的纳米嘧菌酯超分子自组装微球p-mjz。

使用高效液相色谱、核磁共振仪、透射电子显微镜、马尔文粒度仪等对制备的纳米嘧菌酯进行表征结果如下：

实验一：p-mjz负载率分析方法：

称取98％嘧菌酯原药0.05g(精确至0.0002g)于25ml清洁、干燥的容量瓶中，使用二氯甲烷溶解并稀释至刻度，用超声波超声5min，摇匀。待溶液冷至室温后，用移液管准确移取出1ml，置于另一10ml清洁、干净的容量瓶中，使用甲醇溶解并稀释至刻度，使用0.47μm滤膜过滤后，作为高效液相色谱分析的标准样品。

称取制备的纳米嘧菌酯超分子微球0.05g(精确至0.0002g)于25ml清洁、干燥的容量瓶中，使用二氯甲烷溶解并稀释至刻度，用超声波超声25min，摇匀。待溶液冷至室温后，用移液管准确移取出1ml，置于另一10ml清洁、干净的容量瓶中，使用甲醇溶解并稀释至刻度，使用0.47μm滤膜过滤后，进液相分析。

使用高效液相色谱进行峰面积比对，确定含量。

液相方法：

流动相：甲醇+水＝65+35；

流动相流量：1.0ml/min；

柱温：30℃(±0.5℃)；

紫外检测波长：276nm；

进样体积：20μl；

色谱柱：zorbaxods柱(250mmx4.6mm，5μm)；

检测器灵敏度(afus)：2.0；

保留时间8.438min；

所制备的纳米嘧菌酯微球的收率y(yield)按照如下公式进行计算：

y表示收率；s表示产物纳米超分子聚合体的质量；d表示投入的总药量；p表示投入的前段聚合物peg-pca-peg质量。

负载率ee(encapsulationeffficiency)计算公式如下

dt表示所制备的纳米超分子微球中实际含药量；d表示投入的总药量。

载药量lc(loadingcapacity)计算公式如下：

dt表示所制备的纳米超分子微球中实际含药量；s表示产物纳米超分子聚合体的质量。

表1不同比例纳米嘧菌酯微球粒径和载药量变化情况

备注说明：将实施例1和实施例2中的98％嘧菌酯原药的用量由2g改成4g，能相应获得表1中的其余2个案例。

由表1，可以看出在固定聚合物和嘧菌酯投药量均为2g时，所使用的聚合物中柠檬酸/聚乙二醇的摩尔比越大，所制备的嘧菌酯纳米微球粒径越大，载药量也越高，最大载药量可达36.7％；同时在固定聚合物投药量为2g，增大嘧菌酯投入量，对负载率没有影响。

使用马尔文激光粒度分布仪对实施例1中制备的p-mjz进行粒度分布测试，结果如图6所示。从图6中可以看出，使用本发明所制备的纳米嘧菌酯微球的平均粒径等于60nm，分布均匀。使用激光粒度仪对市场上采购的嘧菌酯原药进行测量，结果表明嘧菌酯原药粒径约240μm，远远大于纳米嘧菌酯微球。

将实施例1中制备的同样质量的p-mjz置于三个透析袋中，分别置于ph＝10的氨氯化铵缓冲溶液、ph＝7的pbs缓冲液和ph＝5的醋酸缓冲溶液中，使用磁力搅拌，搅拌透析体系，每间隔3h取出1ml透析液用于分析嘧菌酯浓度，取出1ml透析液后，再向体系内补加1ml新鲜的缓冲液，保持体系在一定的体积，对照组(ck)为同等质量的嘧菌酯原药，放置在ph＝10的缓冲液中，按同样操作方式进行处理。使用高效液相色谱对所取的样品进行分析，计算嘧菌酯的释放率和累积释放情况，结果如图8和图9所示。

从图8中可以看出，与对照组相比，p-mjz中嘧菌酯的释放速率明显比对照组慢，说明p-mjz具备显著的缓释能力，在ph＝10和ph＝5的环境中，嘧菌酯的释放速率快于ph＝7的环境中嘧菌酯释放速率，但都比对照组慢。

从图9中可以看出，与对照组相比p-mjz能够缓慢释放出内含的嘧菌酯。当ph＝7时，p-mjz中嘧菌酯累积释放率缓慢增加，在15h时达到80％，当ph＝10，和ph＝5时，p-mjz中嘧菌酯累积释放率明显高于ph＝7时，并在10h达到88％，此后几乎不再增加。ph＝10和ph＝5时释放速率和累积释放率都明显高于ph＝7时，可能原因是pca和peg结合的酯键在弱碱性环境下分解，使纳米嘧菌酯微球结构崩解，嘧菌酯较快的从微球中释放出来。

使用高效液相色谱对实施例1-5中所制备的不同聚合物柠檬酸/聚乙二醇摩尔比的五种超分子共聚体微球进行负载率测试，即，使用高效液相色谱分别对不同ca：peg摩尔比的嵌段共聚物与嘧菌酯制备的超分子共聚物进行负载率和载药量测试。所制备的含药超分子共聚体的载药量和负载率随所使用的pca-peg-pca嵌段共聚物中ca：peg比例提高而逐渐增高。其中嘧菌酯超分子微球的负载率最低为22.7％，最高为38.7％，载药量最低为17.1％，最高为36.7％。

使用柠檬酸/聚乙二醇的嵌段树枝状聚合物制备的超分子聚合物的负载率随柠檬酸和聚乙二醇摩尔比增大而增高，可能原因是，在柠檬酸/聚乙二醇的嵌段树枝状聚合物分子中，起聚合作用的主要是分子两端树状分支的聚柠檬酸(pca)，聚柠檬酸中含有大量未聚合的羧基、羟基和氧原子，这些基团可以与邻近的分子上的氢原子、氧原子、氟原子、氮原子等形成氢键，所以随着柠檬酸比例的提高，柠檬酸/聚乙二醇的嵌段树枝状聚合物体系的负载率也会上升，但是随着柠檬酸比例的提高，柠檬酸/聚乙二醇的嵌段树枝状聚合物的粘度会逐渐增大，从无色透明(ca：peg＝2：1)到黄色固体(ca：peg＝10:1)。

生物活性测试：参照《农药生物活性评价sop》。

选取水稻稻瘟病菌riceblast(magnaporthegrisea)：参照生测标准方法ny/t1156.2-2006，采用含药培养基法：取嘧菌酯原药和本发明制备的载药量为36.7％纳米嘧菌酯微球(实施例1)，以有效浓度为1mg/l、5mg/l、10mg/l、20mg/l，配制成含药培养基平板。然后从培养好的试验病菌菌落边缘取6.5mm直径菌丝块，移至含药培养基上，每处理4次重复。处理完毕，置于28℃的恒温生化培养箱中培养，4天后测量菌落直径，计算生长抑制率。

分别观察1-9天抑制率大小，具体如图10所示。

从图10中可以看出，在前6天，嘧菌酯原药对稻瘟病的抑制率高于p-mjz对稻瘟病的抑制率，但是随着时间的延长，嘧菌酯原药的抑制率缓慢下降，而p-mjz对稻瘟病的抑制率逐渐增加，并在第七日时超过原药对稻瘟病的抑制率，该结果表明，p-mjz具备延长嘧菌酯持效期的作用。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。