专利名称：一种制备小干涉rna分子的方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域中一种制备小干涉RNA分子的方法。
背景技术：
RNA干涉(RNA interference，RNAi)是指双链RNA会引起细胞内同源基因mRNA的特异性降解。自然界的RNAi反应中，RNase III家族的核酸酶Dicer把长双链RNA切割成21-25bp的小干涉RNA(short interfering RNA，siRNA)，这些siRNA和相关蛋白组装成“RNA引起的沉默复合物”(RNA-induced silencing complex，RISC)，随后使同源基因的mRNA降解。在线虫、果蝇等低等生物中，可以引入长双链RNA来抑制靶基因的表达。但是在哺乳动物细胞中，长双链RNA(＞30bp)会引起干扰素反应，使细胞凋亡。而直接用＜30bp的siRNA转染哺乳动物细胞，既能引起RNAi，又可以避免干扰素反应。
siRNA的具体结构如图1a和图1b所示，一般是21bp的双链RNA，其中19bp互补，双链的3’端都有2个U或T的突出端。
获得siRNA的方法一般采用化学合成或体外转录。化学合成方法对RNA的序列没有限制，但是价格昂贵。用T7 RNA聚合酶体外转录的方法虽然便宜，但是为了T7RNA聚合酶能够有效转录，要求转录物的前2个碱基必须是GG或GA，这样mRNA靶序列就必须是5’-AAGG-N16-C-3’或5’-AAGA-N16-C-3’，极大地限制了靶序列的选择。因为siRNA对基因表达的抑制作用随着作用靶位的不同变化很大，所以靶序列选择受限制就直接影响有效siRNA的获得，这就使体外转录制备siRNA的方法得不到广泛应用。
发明创造内容本发明的目的是提供一种制备小干涉RNA分子的方法。
本发明所提供的制备小干涉RNA分子的方法，包括以下步骤1)分别合成小干涉RNA分子的正义链和反义链的DNA模板及通用杂交寡核苷酸；所述小干涉RNA分子的正义链和反义链的DNA模板均为互补的双链；所述DNA模板的有义链白5′到3′方向依次包括启动子序列、不含有碱基T的引导序列、与该引导序列紧密相连的靶序列和与该靶序列紧密相连的3′末端的两个碱基TT；所述通用杂交寡核苷酸为与所述引导序列互补的单链寡核苷酸；2)分别用RNA聚合酶将步骤1)中合成的小干涉RNA分子的正义链和反义链的DNA模板转录出一端带有步骤1)所述DNA模板的有义链中的引导序列的正义链RNA和反义链RNA；3)将带有步骤1)所述DNA模板的有义链中的引导序列的正义链RNA和反义链RNA等摩尔比混合，并退火得到两端带有步骤1)所述DNA模板的有义链中的引导序列的双链RNA；4)以与步骤3)中所述双链RNA 2∶1的摩尔比加入所述通用杂交寡核苷酸，反应形成DNA-RNA杂合分子；用RNase H切除所述DNA-RNA杂合分子中带有的步骤1)所述DNA模板的有义链中的引导序列，得到小干涉RNA分子。
步骤1)中所述启动子为T7启动子，该T7启动子序列可为5’-TAATACGACTCACTATA。所述引导序列的长度可为8-16bp；优选为10bp；所述引导序列与T7启动子序列紧密相连的两个碱基是GG或GA；所述引导序列的Tm值为30-37℃。所述DNA模板的两条链和通用杂交寡核苷酸由化学合成法合成；所述DNA模板的两条链在85℃水浴1分钟，然后37℃水浴10分钟退火，即得到所需的DNA模板。
步骤2)中所述RNA聚合酶可为T7 RNA聚合酶，可用T7 RNA聚合酶的体外转录试剂盒将所述DNA模板转录为带有所述引导序列的正义链RNA和反义链RNA；剩余的DNA模板可用DNase I去除，DNase I的用量可为1单位，作用时间可为20分钟-1小时。
步骤3)中的退火反应条件为90℃水浴1分钟，然后37℃水浴10分钟。
步骤4)中的RNase H的用量为每微克通用杂交寡核苷酸用20单位RNase H；通用杂交寡核苷酸可用DNase I去除，DNase I的用量可为每微克通用杂交寡核苷酸用1单位，作用时间可为20分钟-1小时。
本发明中的有义链是指在转录过程中，DNA双链中不做模板的那条DNA单链。
本发明的原理是首先在靶序列前加入一段引导序列，保证体外转录反应在一定的位置起始并且可以有很高的转录效率。但是这样得到的转录物比需要的序列多了一段引导序列转录出来的RNA。然后用引导序列的互补序列合成DNA作为通用杂交寡核苷酸，与转录物中的引导序列部分形成DNA-RNA杂合链，利用RNase H可以降解DNA-RNA杂合链中的RNA片段，同时对单链RNA、双链RNA以及DNA都没有作用的特性，去掉转录物中多余的引导序列转录出的部分片段，从而最终得到所需的siRNA。
本发明创造性地引入了前2个碱基是GG或GA的引导序列，使转录在第一个G处开始，保证了体外转录在确定的位置起始并且具有很高的转录效率，如在5’-TAATACGACTCACTATAGG(A)……-3’序列中，转录从加粗的G处开始。
本发明对现有的体外转录制备siRNA的方法进行了改进，使靶序列的选择不再受到限制。本发明的方法效率高、成本低而且靶序列选择不受限制，将在小干涉RNA分子的制备中得到广泛应用。
图1a为siRNA的一般结构示意1b为siRNA的一般结构示意2为双链RNA用RNase H切割成siRNA的示意3为siRNA的PAGE电泳4a-4c为siRNA对EGFP基因表达的抑制结果照片图4a为无siRNA时EGFP的表达情况照片图4b为5nmol/L siRNA时EGFP的表达情况照片图4c为50nmol/L siRNA时EGFP的表达情况照片具体实施方式
实施例1、抑制增强型绿色荧光蛋白基因表达的siRNA的合成以增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluoresence proteinEGFP)基因的靶序列5’-AACTACAACAGCCACAACGTC-3’为例，说明相应siRNA的制备方法。
1.DNA模板及通用杂交寡核苷酸的设计与合成用化学合成法合成DNA模板片段E1(序列表中的SEQ ID №1)和E2(序列表中的SEQ ID №1)、E3(序列表中的SEQ ID №1)和E4(序列表中的SEQ ID №1)，然后分别在85℃水浴1分钟，然后37℃水浴10分钟退火，得到正义链RNA的DNA模板和反义链RNA的DNA模板。
E15’-TAATACGACTCACTATAGGGAGACAGGCAGCCACAACGTCTATATCTT-3’E25’-AAGATATAGACGTTGTGGCTGCCTGTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA-3’E35’-TAATACGACTCACTATAGGGAGACAGGGATATAGACGTTGTGGCTGTT-3’E45’-AACAGCCACAACGTCTATATCCCTGTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA-3’正义链RNA的DNA模板 反义链RNA的DNA模板 正义链RNA和反义链RNA的DNA模板序列中，带下划线的碱基对为T7启动子序列，带双下划线的碱基对为引导序列，带波浪线的碱基对为靶序列，
用化学合成法合成通用杂交寡核苷酸，它为与DNA模板的有义链中的引导序列互补的单链DNA片段5’-CCTGTCTCCC-3’。
2.RNA的体外转录用包含T7 RNA聚合酶的体外转录试剂盒RiboMAXTMT7 Express System(Promega公司)分别转录出正义链RNA和反义链RNA正义链RNA序列5’-GGGAGACAGGCAGCCACAACGUCUAUAUCUU-3’反义链RNA序列5’-GGGAGACAGGGAUAUAGACGUUGUGGCUGUU-3’用1单位RQ1 RNase-Free DNase(Promega公司)37℃水浴40分钟去除剩余的DNA模板。分别乙醇沉淀回收正义链RNA和反义链RNA。DEPC-水分别溶解正义链RNA和反义链RNA，紫外分光光度法测RNA浓度。
3.双链RNA的RNase H切割反应根据正义链RNA和反义链RNA的浓度，以1∶1的摩尔比混合，90℃水浴1分钟，然后37℃水浴10分钟退火成双链RNA。以2∶1的摩尔比加入通用杂交寡核苷酸，每微克通用杂交寡核苷酸用20单位RNase H(TaKaRa公司)，30℃水浴40分钟切割DNA-RNA杂合分子中的RNA链(图2)。然后，以每微克通用杂交寡核苷酸1单位RQ1 RNase-Free DNase(Promega公司)的比例37℃水浴40分钟去除通用杂交寡核苷酸，然后用乙醇沉淀，晾干沉淀物，用DEPC-水溶解，就得到针对EGFP基因的siRNA。紫外分光光度法测RNA浓度。制备的siRNA的序列是5’-CUACAACAGCCACAACGUCUU-3’3’-UUGAUGUUGUCGGUGUUGCAG-5’将得到的siRNA进行15％PAGE，结果如图3所示，表明该siRNA的大小为20bp左右。图3中，1为10bp DNA分子量标准(100，90，80，70，60，50，40，30，20，10bp)，2为siRNA。
4.siRNA抑制EGFP基因的表达96孔板HeLa细胞长到汇合度30-50％开始转染，转染试剂用Lipofectamine2000(Invitrogen公司)，每孔细胞转染试剂用0.5微升，pEGFP-C1(CLONTECH公司)用0.1微克，siRNA分别用0、5nmol/L、50nmol/L，细胞转染4小时后换培养液，24小时后用荧光显微镜观察。结果如图4a-4c所示，表明siRNA和能在哺乳动物细胞内表达EGFP的质粒pEGFP-C1(CLONTECH公司)共转染HeLa细胞，5nmol/L的siRNA就可以有效抑制EGFP基因的表达。
序列表<160>4<210>1<211>48<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1taatacgact cactataggg agacaggcag ccacaacgtc tatatctt 48<210>2<211>48<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>2aagatataga cgttgtggct gcctgtctcc ctatagtgag tcgtatta 48<210>3<211>48<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>3taatacgact cactataggg agacagggat atagacgttg tggctgtt 48<210>4<211>48<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>4aacagccaca acgtctatat ccctgtctcc ctatagtgag tcgtatta 48
权利要求
1.一种制备小干涉RNA分子的方法，包括以下步骤1)分别合成小干涉RNA分子的正义链和反义链的DNA模板及通用杂交寡核苷酸；所述小干涉RNA分子的正义链和反义链的DNA模板均为互补的双链；所述DNA模板的有义链自5′到3′方向依次包括启动子序列、不含有碱基T的引导序列、与该引导序列紧密相连的靶序列和与该靶序列紧密相连的3′末端的两个碱基TT；所述通用杂交寡核苷酸为与所述引导序列互补的单链寡核苷酸；2)分别用RNA聚合酶将步骤1)中合成的小干涉RNA分子的正义链和反义链的DNA模板转录出一端带有步骤1)所述DNA模板的有义链中的引导序列的正义链RNA和反义链RNA；3)将带有步骤1)所述DNA模板的有义链中的引导序列的正义链RNA和反义链RNA等摩尔比混合，并退火得到两端带有步骤1)所述DNA模板的有义链中的引导序列的双链RNA；4)以与步骤3)中所述双链RNA 2∶1的摩尔比加入所述通用杂交寡核苷酸，反应形成DNA-RNA杂合分子；用RNase H切除所述DNA-RNA杂合分子中带有的步骤1)所述DNA模板的有义链中的引导序列，得到小干涉RNA分子。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤1)中所述启动子为T7启动子，该T7启动子序列为5’-TAATACGACTCACTATA；所述步骤2)中的RNA聚合酶为T7 RNA聚合酶。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤1)中所述引导序列的长度为8-16bp。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于步骤1)中所述引导序列的长度为10bp。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述引导序列与启动子序列紧密相连的两个碱基是GG或GA。
6.根据权利要求3或4或5所述的方法，其特征在于所述引导序列的Tm值为30-37℃。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤2)中剩余的DNA模板用DNaseI去除，DNase I的用量为1单位，作用时间为20分钟-1小时。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤3)中的退火反应条件为90℃水浴1分钟，然后37℃水浴10分钟。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤4)中的RNase H的用量为每微克通用杂交寡核苷酸用20单位RNase H。
10.根据权利要求1或9所述的方法，其特征在于步骤4)中通用杂交寡核苷酸用DNase I去除，DNase I的用量为每微克通用杂交寡核苷酸用1单位，作用时间为20分钟-1小时。
全文摘要
本发明公开了一种制备小干涉RNA分子的方法。它包括以下步骤1)分别合成小干涉RNA分子的正义链和反义链的DNA模板及通用杂交寡核苷酸；所述DNA模板的有义链自5′到3′方向依次包括启动子序列、不含有碱基T的引导序列、与该引导序列紧密相连的靶序列和与该靶序列紧密相连的3′末端的两个碱基TT；所述通用杂交寡核苷酸为与所述引导序列互补的单链寡核苷酸；2)分别用RNA聚合酶转录出一端带有所述引导序列的正义链RNA和反义链RNA；3)将正义链RNA和反义链RNA等摩尔比混合，并退火得到两端带有所述引导序列的双链RNA；4)以与所述双链RNA 2∶1的摩尔比加入通用杂交寡核苷酸，得到DNA－RNA杂合分子；用RNase H切除所述杂合分子中带有的引导序列，得到小干涉RNA分子。
文档编号C12P19/00GK1690217SQ20041003402
公开日2005年11月2日 申请日期2004年4月21日 优先权日2004年4月21日
发明者朱旭东, 黄培堂 申请人:中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所