专利名称：：一种提高羊草愈伤组织分化率的方法及其专用培养基的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种提高羊草愈伤组织分化率的方法及其专用培养基。
背景技术：
：羊草隶属于单子叶植物纲、禾本科、禾亚科、早熟禾系、大麦族、野麦亚族、赖草属植物，是欧亚大陆草原区东部的重要草原建群种之一。作为一种重要的牧草资源，羊草具有产量高、抗逆性强、动物适口性好、营养丰富等诸多优点；同时，羊草还对不同生态环境具有较强的适应性，对改善我国北方草原生态环境和治理盐渍化土地具有重大意义。多年来，人们主要通过传统育种技术驯化和改良羊草群体，选育优良品种，而传统育种技术却具有工作量大、周期长、目的性差等局限性。近些年，随着植物基因工程的迅速发展，利用转基因技术培育和改良植物品种已逐渐成为一种便捷、实用的重要途径(魏琪，胡国富，李凤兰，胡宝忠。羊草种子愈伤组织的诱导及植株再生。东北农业大学学报，36(1)41-44)。在羊草高效遗传转化体系的建立中，愈伤组织再生植株是一个关键因素。衡量羊草植株再生能力的指标主要有愈伤组织分化率(％)＝(分化愈伤数/接种的愈伤组织块数)×100；不定芽分化率(％)＝(分化芽数/接种的愈伤组织块数)×100。而通常羊草愈伤组织的分化率很低，已有文献报道羊草愈伤组织分化率为16％-24％(曲同宝，王丕武，关淑艳，刘玲芝。羊草组织培养及再生系统的建立。草业学报，13(5)91-94；魏琪，胡国富，李凤兰，胡宝忠。羊草种子愈伤组织的诱导及植株再生。东北农业大学学报，36(1)41-44)，而不定芽分化率仅有26.67％(魏琪，胡国富，李凤兰，胡宝忠。羊草种子愈伤组织的诱导及植株再生。东北农业大学学报，36(1)41-44)。可见分化率低成为制约遗传转化率的瓶颈，因此提高愈伤组织的分化率至关重要。
发明内容本发明的目的是提供一种提高羊草愈伤组织分化率的方法及其专用培养基，以解决羊草组织培养过程中分化率过低的问题。本发明所提供的提高羊草愈伤组织分化率的培养基是添加0.3-2.5mg/L6-BA和0.3-2.5mg/LKT，并用30-90g/L麦芽糖替代蔗糖的N6固体培养基。所述6-BA的浓度优选为1.5mg/L，所述KT的浓度优选为1.5mg/L。本发明所提供的提高羊草愈伤组织分化率的方法，是将愈伤组织置于预分化培养基中进行预分化培养20-30天，然后接种在上述提高羊草愈伤组织分化率的培养基上进行分化培养，直到分化出芽；所述预分化培养基是添加0.05-1mg/L2，4-D的基础培养基。所述基础培养基可为N6培养基KNO32800mg/L，(NH4)2SO4463mg/L，KH2PO4400mg/L，MgSO4·7H2O185mg/L，CaCl2·2H2O165mg/L，Na2-EDTA37.3mg/L，FeSO4·7H2O27.8mg/L，MnSO4·H2O4.4mg/L，ZnSO4·7H2O1.5mg/L，H3BO31.6mg/L，KI0.8mg/L，维生素B11mg/L，维生素B60.5mg/L，叶酸0.5mg/L，蔗糖30g/L，pH5.8。所述预分化培养基分为预分化培养基I和预分化培养基II；所述预分化培养基I为添加0.07-1mg/L2，4-D的基础培养基；所述预分化培养基II为添加0.05-1mg/L2，4-D的基础培养基。在使用时，预分化培养基I和预分化培养基II分阶段使用。所述预分化培养基I中2，4-D的浓度优选为0.5mg/L；所述预分化培养基II中2，4-D的浓度优选为0.3mg/L。所述预分化培养为先将愈伤组织置于所述预分化培养基I中培养10-15天，再在所述预分化培养基II培养10-15天。实验证明，本发明方法处理的愈伤组织分化率可达到51.70％，不定芽分化率可达到112.11％，是已有文献报道的最高分化率的2倍和4倍左右。本发明方法简单易行，无需复杂操作，即可有效提高羊草愈伤组织的分化率，有助于提高羊草的遗传转化率，具有重要的实际意义。具体实施例方式下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。实施例1、高羊草愈伤组织培养分化及其效果1、羊草种子的处理挑选饱满当年生羊草种子，去掉种皮，在超净工作台内用75％的酒精浸泡45秒，然后用无菌水冲洗干净，再用2％次氯酸钠浸泡消毒10分钟，其间不断摇晃，保证消毒彻底，再用无菌水冲洗干净。2、愈伤组织的诱导将600颗无菌种子，接种在添加2.0mg/L2，4-D，7.5g/L琼脂，30g/L蔗糖，pH5.8的N6培养基上，25℃恒温暗培养，作为实验组。N6培养基KNO32800mg/L，(NH4)2SO4463mg/L，KH2PO4400mg/L，MgSO4·7H2O185mg/L，CaCl2·2H2O165mg/L，Na2-EDTA37.3mg/L，FeSO4·7H2O27.8mg/L，MnSO4·H2O4.4mg/L，ZnSO4·7H2O1.5mg/L，H3BO31.6mg/L，KI0.8mg/L，维生素B11mg/L，维生素B60.5mg/L，叶酸1mg/L，蔗糖30g/L，pH5.8。3、愈伤组织的继代步骤2中实验组诱导愈伤组织的600颗无菌种子中，130颗无菌种子形成愈伤组织，将其中108个紧密型愈伤组织转到含有1mg/L2，4-D的N6固体培养基上继续培养，每3-4周继代1次，进行3-4次继代。4、愈伤组织的分化将步骤3实验组得到的3-4次继代的愈伤组织，分为三组，实验组1、实验组2、实验组3，分别先后置于预分化培养基I(2，4-D浓度为0.07、0.5或1mg/L的基础培养基)和预分化培养基II(0.05、0.3或1mg/L的N6培养基)中分别预分化两周，在26℃光照强度为1600lx(勒克斯)的条件下培养28天，从而获得较多的胚性愈伤组织，然后接种在分化培养基上。分化培养基是pH5.8，添加1.5mg/L6-BA和1.5mg/LKT，并用60g/L麦芽糖代替蔗糖的N6固体(添加琼脂7.5g/L)培养基。实验组1、实验组2、实验组3所用培养基的具体组分和其含量如表1所示。计算愈伤组织分化率(分化的愈伤组织块数/接种的愈伤组织块数)和不定芽分化率(分化出的芽数/接种的愈伤组织块数)结果如表1所示，表明实验组1、实验组2、实验组3的愈伤组织分化率和不定芽分化率比对照分别提高73.38％和178.70％、115.42％和320.36％、68.83％和239.97％；另外实验组1、实验组2、实验组3是已有文献报道(曲同宝，王丕武，关淑艳，刘玲芝。羊草组织培养及再生系统的建立。草业学报，13(5)91-94；魏琪，胡国富，李风兰，胡宝忠。羊草种子愈伤组织的诱导及植株再生。东北农业大学学报，36(1)41-44)的最高分化率的2倍和4倍左右。表1羊草愈伤组织在不同培养基上的分化频率和平均再生芽数<tablesid="table1"num="001"><tablewidth="877">组别预分化培养基成分(mg/L)2，4-D分化培养基成分(mg/L)愈伤组织分化率(分化的愈伤组织块数/接种的愈伤组织块数)不定芽分化率(分化山的芽数/接种的愈伤组织块数)III6-BAKT麦芽糖实验组1实验组2实验组3对照组0.070.51--0.050.31--1.51.51.5--1.51.51.5--606060--41.61％51.70％40.52％24％74.33％112.11％90.67％26.67％</table></tables>将实验组1、实验组2、实验组3得到的不定芽移到N6生根培养基7-12天后全部分化出根，继续在N6培养壮苗，结果表明所有分化苗全部成活。权利要求1.一种提高羊草愈伤组织分化率的培养基，是添加0.3-2.5mg/L6-BA和0.3-2.5mg/LKT，并用30-90g/L麦芽糖替代蔗糖的N6固体培养基。2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于所述6-BA的浓度为1.5mg/L，所述KT的浓度为1.5mg/L，所述麦芽糖浓度为60g/L。3.一种提高羊草愈伤组织分化率的方法，是将愈伤组织置于预分化培养基中进行预分化培养20-30天，然后接种在权利要求1或2所述分化培养基上进行分化培养，直到分化出芽；所述预分化培养基是添加0.05-1mg/L2，4-D的基础培养基。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述基础培养基为N6培养基KNO32800mg/L，(NH4)2SO4463mg/L，KH2PO4400mg/L，MgSO4·7H2O185mg/L，CaCl2·2H2O165mg/L，Na2-EDTA37.3mg/L，FeSO4·7H2O27.8mg/L，MnSO4·H2O4.4mg/L，ZnSO4·7H2O1.5mg/L，H3BO31.6mg/L，KI0.8mg/L，维生素B11mg/L，维生素B60.5mg/L，叶酸1mg/L，蔗糖30g/L，pH5.8。5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于所述预分化培养基分为预分化培养基I和预分化培养基II；所述预分化培养基I为添加0.07-1mg/L2，｀4-D的基础培养基；所述预分化培养基II为添加0.05-1mg/L2，4-D的基础培养基。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述预分化培养基I中2，4-D的浓度为0.5mg/L；所述预分化培养基II中2，4-D的浓度为0.3mg/L。7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述预分化培养为先将愈伤组织置于所述预分化培养基I中培养10-15天，再在所述预分化培养基II培养10-15天。全文摘要本发明公开了一种提高羊草愈伤组织分化率的方法及其专用培养基。提高羊草愈伤组织分化率的培养基是添加0.3－2.5mg/L6－BA和0.3－2.5mg/LKT，并用30－90g/L麦芽糖替代蔗糖的N6固体培养基。提高羊草愈伤组织分化率的方法，是将愈伤组织置于预分化培养基中进行预分化培养20－30天，然后接种在该提高羊草愈伤组织分化率的培养基上进行分化培养，直到分化出芽；所述预分化培养基是添加0.05－1mg/L2，4－D的基础培养基。本发明的特点是方法简单易行，无需复杂操作，即可有效提高羊草愈伤组织的分化率，有助于提高羊草的遗传转化率，具有重要的实际意义。文档编号C12N5/04GK1843098SQ20061007840公开日2006年10月11日申请日期2006年5月24日优先权日2006年5月24日发明者刘公社,李晓峰,苏蔓,齐冬梅申请人:中国科学院植物研究所