专利名称：F2湿加松体细胞诱导方法
技术领域：
本发明属于植物体细胞胚胎工程技术领域，具体涉及F2湿加松体细胞诱导方法。
背景技术：
F2湿加松是湿地松(Pinus elliottii var.elliottii Engelm)与加勒比松(Pinus caribeae Morelet)杂交产生的后代。湿地松与加勒比松杂交育种由澳大利亚人NIKLES博士等人于1955年首创。其形态接近湿地松，是利用湿地松和加勒比松基因重组，使两个亲体树种的优良性状在杂种子代中同时得到表现。在我国长江以南绝大部分地区均能适应种植，湿加松具有生长快、节间距离长、含油脂高、少虫害、适生范围广等特性，其早期材积增益可达亲体的3倍以上，而且表现出较强的抗松突圆蚧能力，是值得大力推广的优良树种。
但是，由于我国开展湿加松育种时间尚短，杂种种子生产成本高、种子产量低，而且用种子繁殖，个体分化大，难以保持湿加松母体的性状；采用常规的扦插、压条或嫁接等无性繁殖方法，繁育速度慢，难以满足日益增长的市场需求。
体细胞诱导技术作为现代生物技术的一个重要组成部分，具有速度快、周期短、不受季节影响、后代稳定性高等特点。目前在我国对于F2湿加松体细胞诱导技术还没有相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供F2湿加松体细胞诱导方法，以加快繁育速度，缩短周期，实现F2湿加松的大规模、快速繁殖。
为了实现上述目的，本发明的解决方案一是以成熟种子为材料，经预处理、消毒、冲洗，剥出种胚种于诱导培养基上，诱导培养基配方为以DCR为基本培养基，含有2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)9.0-13.0mg/L、6-BA(6-卞基嘌呤)1.6-2.2mg/L、KT(6-糠氨基嘌呤)1.6-2.2mg/L，培养条件23±1℃，黑暗培养。
其中，成熟种子预处理是将成熟种子采回后，用牛皮纸包裹，然后在外面套一层塑料袋，密封后在4℃避光储存2个月。
成熟种子消毒、冲洗是种子在4℃冷藏2个月后，用75％酒精消毒30秒，用无菌水冲洗3次，再用0.1％的氯化汞消毒10分钟，用无菌水冲洗8次。
本发明的解决方案二是以幼嫩茎段为材料，经预处理、消毒、冲洗，切取1-2cm的小段接种到诱导培养基上，诱导培养基配方为以SH为基本培养基，含有2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)5.0-10.0mg/L、6-BA(6-卞基嘌呤)1.1-2.0mg/L、KT(6-糠氨基嘌呤)1.1-2.0mg/L，培养条件23±1℃，黑暗培养。
其中，幼嫩茎段预处理是选出优良单株和健康、粗壮的母株后，在9月--10月对优树上的新萌枝条进行嫁接，等到嫁接枝条萌发新芽后，从芽基部剪掉丛芽，这样反复去芽几次后，取其新萌发5-10cm的嫩芽。
幼嫩茎段消毒、冲洗是将萌芽条采回后，用流水冲洗30分钟，然后在无菌工作台上用75％酒精消毒30秒，无菌水冲洗3次，再用0.1％的氯化汞消毒4分30秒。
采用上述方法后，本发明选种胚接种到诱导培养基1周后，胚体开始膨大，1个月后从子叶处开始出现愈伤组织，愈伤组织分为4种类型①白色，半透明，有光泽的粘性愈伤组织；②淡黄色，疏松的颗粒状愈伤组织；③浅白色，水浸状的愈伤组织；④淡绿色，疏松的颗粒状愈伤组织。按四种愈伤组织类型分别转接到激素浓度只有诱导培养基浓度1/10的继代培养基上。培养二个月左右，愈伤组织的具体表现为①颜色淡黄，呈颗粒状的愈伤组织逐渐褐化死亡；②颜色白色，颗粒状的可以增殖，但细胞团没有粘性；③愈伤组织松散，颜色黄色的也逐渐死亡；④颜色白色，呈半透明，具有粘性的愈伤组织增殖较好。这样，在继代培养基中连续培养几代至十几代，挑选颜色白色，呈半透明，具有粘性的愈伤组织进行增殖。经过十几代连续挑选培养后，通过显微镜观察，细胞团中的细胞已经全部为胚性细胞。至此，建立起湿加松成熟合子胚胚性愈伤组织体系。
本发明选幼嫩茎段接种到诱导培养基1个半月后，在茎段的切口处先出现浅绿色愈伤组织，愈伤组织呈颗粒状，在针叶与茎段的结合处，出现白色、半透明，愈伤组织呈团状。挑选白色、半透明，呈团状的愈伤组织转接到以BM基本培养基，添加生长素2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)1.2-2.0mg/L，分裂素6-BA(6-卞基嘌呤)0.25-0.5mg/L，KT(6-糠氨基嘌呤)0.25-0.5mg/L，肌醇1g/L，麦芽糖20-30g/L，渗透压为140-160mmol/L的继代培养基中，每12天左右增殖一次，在继代培养基中连续培养几代至十几代，每次挑选颜色白色，呈半透明，具有粘性的愈伤组织进行增殖。经过十几代连续挑选培养后，通过显微镜观察，细胞团中的细胞已经全部为胚性细胞。至此，建立起湿加松幼嫩茎段的胚性愈伤组织体系。
这样，再取胚性愈伤组织进行继代增殖培养，12-15天继代一次，直到有足够的胚性材料进入液体培养基增殖培养，可达到快速生长的目的。然后进入成熟胚的培养、萌发、移栽，即可进行商业销售。本发明是一种新型的林木育种方法，实现了F2湿加松大规模、快速繁殖的目的。
具体实施例方式
运用本发明进行F2湿加松繁殖时，首先对成熟胚及幼嫩茎段进行预处理，然后进行愈伤组织诱导，并结合培养基的调整来筛选出胚性愈伤组织，最后进入继代增殖。具体操作步骤如下(1)材料的采集及预处理成熟合子胚成熟种子采回后，用牛皮纸包裹，然后在外面套一层塑料袋，密封后在4℃避光储存2个月。
幼嫩茎段选出优良单株和健康、粗壮的母株后，在9月--10月对优树上的新萌枝条进行嫁接，嫁接材料选择种子园优良单株新萌枝条。等到母株嫁接枝条萌发新芽后，从芽基部剪掉丛芽，这样反复去芽几次，取其新萌发5-10cm的嫩芽作为实验材料。
(2)培养基的制备①按组织培养常规方法配制好诱导培养基成熟胚的诱导培养以DCR为基本培养基，含有2，4-D 11.0mg/L、6-BA 2.0mg/L、KT 2.0mg/L；幼嫩茎段在以SH为基本培养基，添加2，4-D 5.0-10.0mg/L、6-BA 1.1-2.0mg/L、KT 1.1-2.0mg/L的诱导培养基上。
②分装、高压蒸汽灭菌、冷却后备用。
(3)诱导阶段在无菌条件下，对成熟种子在4℃冷藏2个月后，用75％酒精消毒30秒，用无菌水冲洗3次，再用0.1％的氯化汞消毒10分钟，用无菌水冲洗8次后，小心剥出种胚接种于诱导培养基上；对嫩芽，萌芽条采回后，用流水冲洗30分钟，然后在无菌工作台上用75％酒精消毒30秒，无菌水冲洗3次，再用0.1％的氯化汞消毒4分30秒，然后切为1-2cm的小段就可以接种到诱导培养基上。
(4)愈伤组织的挑选和继代培养①培养基的配制配制以BM为继代培养的基本培养基，其中添加生长素2，4-D 1.2-2.2mg/L、分裂素6-BA 0.25-0.5mg/L、KT0.25-0.5mg/L、肌醇1g/L、麦芽糖20-30g/L以及各种氨基酸，经过高压蒸汽灭菌后添加麦芽糖再分装，冷却备用。
②种胚接种到诱导培养基1周后，胚体开始膨大，1个月后从子叶处开始出现愈伤组织。愈伤组织经过挑选后从外植体上切下，转入继代培养基(种胚和茎段的继代培养基一样)上进行继代培养，每12-15天继代培养一次。连续培养几代至十几代(二个月左右)，挑选颜色白色，呈半透明，具有粘性的愈伤组织进入液体培养基进行增殖培养，可达到快速生长的目的。然后进入成熟胚的培养、萌发、移栽，即可进行商业销售。
幼嫩茎段诱导培养1个半月后，在茎段的切口处先出现浅绿色，呈颗粒状的愈伤组织，在针叶与茎段的结合处，出现白色，半透明，呈团状的愈伤组织。挑选白色，半透明，呈团状的愈伤组织转接到BM继代培养基中，每12天左右继代一次。在继代培养基中连续培养几代至十几代，每次挑选颜色白色，呈半透明，具有粘性的愈伤组织进入液体培养基进行增殖培养，可达到快速生长的目的。然后进入成熟胚的培养、萌发、移栽，即可进行商业销售。
本发明具有如下优点一、所取材料为成年树嫁接萌芽条，一般在针叶树种的繁育上，采用成熟或未成熟种子作为原始材料，但由于有性繁殖，种子变异较大，使后代不能完全保持母本的优良性状，这样，后代就会表现出不同的性状，根据后代20年左右的生长表现情况来确定优良无性系，然后进行大量繁殖，通过使用嫁接及多次去芽的方法，不仅可以使成年植株达到幼龄化状态，保持母本所具有的优良性状外，而且能提高愈伤组织的诱导率，同时，还可以大大缩短对后代表现性状的观察时间；二、在继代培养阶段，由于胚性和非胚性愈伤组织对培养基的渗透压的适应范围不同，可以通过调整培养基的渗透压来选择胚性愈伤组织，这样不仅可以避免通过显微镜挑选时出现混杂现象，还可以减少因操作污染而导致的材料损失。
权利要求
1.F2湿加松体细胞诱导方法，其特征在于以成熟种子为材料，经预处理、消毒、冲洗，剥出种胚种于诱导培养基上，诱导培养基配方为以DCR为基本培养基，含有2，4-D 9.0-13.0mg/L、6-BA 1.6-2.2mg/L、KT 1.6-2.2mg/L，培养条件23±1℃，黑暗培养。
2.如权利要求1所述的F2湿加松体细胞诱导方法，其特征在于成熟种子预处理是将成熟种子采回后，用牛皮纸包裹，然后在外面套一层塑料袋，密封后在4℃避光储存2个月。
3.如权利要求1所述的F2湿加松体细胞诱导方法，其特征在于成熟种子消毒、冲洗是种子在4℃冷藏2个月后，用75％酒精消毒30秒，用无菌水冲洗3次，再用0.1％的氯化汞消毒10分钟，用无菌水冲洗8次。
4.F2湿加松体细胞诱导方法，其特征在于以幼嫩茎段为材料，经预处理、消毒、冲洗，切取1-2cm的小段接种到诱导培养基上，诱导培养基配方为以SH为基本培养基，含有2，4-D 5.0-10.0mg/L、6-BA 1.1-2.0mg/L、KT 1.1-2.0mg/L，培养条件23±1℃，黑暗培养。
5.如权利要求4所述的F2湿加松体细胞诱导方法，其特征在于其中，幼嫩茎段预处理是选出优良单株和健康、粗壮的母株后，在9月--10月对优树上的新萌枝条进行嫁接，等到嫁接枝条萌发新芽后，从芽基部剪掉丛芽，这样反复去芽几次后，取其新萌发5-10cm的嫩芽。
6.如权利要求4所述的F2湿加松体细胞诱导方法，其特征在于幼嫩茎段消毒、冲洗是将萌芽条采回后，用流水冲洗30分钟，然后在无菌工作台上用75％酒精消毒30秒，无菌水冲洗3次，再用0.1％的氯化汞消毒4分30秒。
全文摘要
本发明公开一种F2湿加松体细胞诱导方法，以成熟种子为材料，经预处理、消毒、冲洗，剥出种胚种于诱导培养基上，诱导培养基配方为以DCR为基本培养基，含有2，4－D 9.0－13.0mg/L、6－BA 1.6－2.2mg/L、KT 1.6－2.2mg/L，培养条件23±1℃，黑暗培养；以幼嫩茎段为材料，经预处理、消毒、冲洗，切取1－2cm的小段接种到诱导培养基上，诱导培养基配方为以SH为基本培养基，含有2，4－D 5.0－10.0mg/L、6－BA 1.1－2.0mg/L、KT 1.1－2.0mg/L，培养条件23±1℃，黑暗培养。本发明可加快繁育速度，缩短周期，实现F2湿加松的大规模、快速繁殖。
文档编号C12N5/04GK101029301SQ20061012223
公开日2007年9月5日 申请日期2006年9月14日 优先权日2006年9月14日
发明者赖桂星, 蔡干强, 林良科, 郑仁华, 苏志强, 赖春阳, 冯鹏 申请人:厦门涌泉科技有限公司