专利名称：一种骨髓神经组织定向干细胞的培养方法
技术领域：
本发明涉及生物组织工程技术领域，是一种制备神经修复移植用的种子细胞---骨髓神经组织定向干细胞的培养方法。
背景技术：
细胞移植的研究为神经系统疾患如脑和脊髓的创伤、脑缺血、帕金森病等退行性疾病的治疗以及周围神经的修复带来了广阔的前景，细胞移植以及组织工程周围神经的关键是种子细胞，目前研究的种子细胞包括胚胎干细胞、神经干细胞、雪旺细胞、嗅鞘细胞、骨髓基质干细胞等等。众多的细胞中，神经干细胞是最佳的选择，神经干细胞的主要来源为胚胎或成体中枢神经组织，但胚胎组织的应用涉及到伦理学和免疫排斥等问题；而成体神经干细胞的位置较深，取材困难，不易获得，且从活体组织中获得神经干细胞具有一定的危险性，用于移植的神经干细胞的来源受到了限制。
近年来，也有学者利用化学诱导剂、生长因子、神经节苷脂等将骨髓基质干细胞诱导分化为类神经细胞。由于诱导分化涉及到部分有毒的化学试剂，如β-巯基乙醇、二甲基亚砜等，已有学者对骨髓基质干细胞的诱导分化提出异议(J Neurosci Res，2004，77(2)174-191，192-204)。诱导分化对细胞进行了非生理状态的干扰，诱导分化后细胞的稳定性、安全性都是值得考虑的。
Kucia M等(Leukemia，2005，19(7)1118-11127.)的研究认为骨髓中含有组织定向干细胞，并采用密度离心、免疫磁珠和荧光激活细胞分离技术(fluorescence-activated cell sorting，FACS)从小鼠骨髓中筛选出了神经组织定向干细胞(neural tissue-committed stem cells，NTCSCs，详见Leukemia，2006，20(1)18-28.)。此方法需首先从骨髓中分离单核细胞，在此基础上通过免疫磁珠正选法筛选出Sca-1+的细胞，通过FACS技术再逐步筛选出Sca-1+/Lin-/CD45-的细胞，这一方法得到的NTCSCs在体外培养可以形成神经球，细胞纯度较高。NTCSCs作为种子细胞为脑、脊髓等神经系统疾患和创伤的修复和治疗提供了广阔的应用前景。但此方法需有专门的免疫磁珠离心仪、FACS仪，价格昂贵，国内多数实验室没有这种条件；此方法操作程序复杂，易污染，且骨髓需要量大，这在临床实际应用中有一定的困难。
发明内容
本发明的目的是提供一种操作简便、成本低廉、骨髓需要量少、神经组织定向干细胞得率高的培养方法。
本发明培养方法包括制备骨髓单核细胞，骨髓单核细胞的贴壁生长、增殖，以及骨髓神经组织定向干细胞的筛选纯化及增殖。其关键在于首先使混合在骨髓单核细胞中的骨髓神经组织定向干细胞在含15％～20％血清的DMEM培养液中贴壁生长、增殖，然后在含2％B27、1％N2、20ng/mlbFGF、20ng/mlEGF的DMEM/F12无血清培养液中筛选纯化、增殖培养。骨髓神经组织定向干细胞在含2％B27、1％N2、20ng/mlbFGF、20ng/mlEGF的DMEM/F12无血清培养液中悬浮生长，并形成细胞球。因此，只要选取细胞球进行培养，就能达到筛选、纯化的目的。
具体培养方法如下1、制备骨髓单核细胞按常规从新鲜骨髓细胞中分离得到骨髓单核细胞。例如取清洁级SD大鼠双侧股骨及胫骨，按常规经NycoPrepTM分离液分离单核细胞层，得骨髓单核细胞。
2、细胞的增殖培养采用含15％～20％胎牛血清的DMEM培养液将上述骨髓单核细胞制备成细胞悬液，接种于培养瓶中，在饱和湿度、37℃、5％CO2孵育培养箱内培养7～10天，待贴壁细胞长满至瓶底的80％～90％时，用0.25％的胰酶消化，再用上述含血清的DMEM培养液终止其消化。
3、骨髓神经组织定向干细胞的筛选、纯化上述培养瓶中细胞经15％～20％胎牛血清的DMEM培养液终止消化后，换用含2％B27、1％N2、20ng/mlbFGF、20ng/mlEGF的DMEM/F12无血清培养液，机械吹打，制成细胞悬液，在饱和湿度、37℃、5％CO2培养箱内培养5～6天后，见由4～16个数量不等的细胞形成的细胞球出现，经鉴定为骨髓神经组织定向干细胞细胞球。待细胞球生长到数十个细胞时，在镜下挑选其中一个较大的细胞球，用移液枪头吸出机械吹打，用上述DMEM/F12无血清培养液进行单克隆培养，待细胞再次形成较大的细胞球时，机械吹打，反复多次进行细胞扩增，并转入较大的培养瓶中培养，就可得到单克隆生长的足量的骨髓神经组织定向干细胞。
具体实施例方式
现结合实施例，对本发明作详细描述。
实施例1制备大鼠骨髓神经组织定向干细胞1、制备骨髓单核细胞清洁级SD大鼠，体质量200g，断头处死，取双侧股骨及胫骨，剔除表面肌肉，剪去双侧骨骺，DMEM培养液冲洗骨髓腔，200目滤网过滤，在离心管中预置3mlNycoPrepTM分离液，将6ml的骨髓细胞滤液轻轻置于NycoPrepTM(AXIS·SHIE/D公司)分离液上，勿混合，以2600r/min离心20min，轻轻吸取分离液上方的单细胞层，加DMEM培养液5ml，以1700r/min离心10min，反复冲洗3次，得到的细胞沉淀即为骨髓单核细胞。
2、细胞的增殖培养将上述骨髓单核细胞用含15％胎牛血清的DMEM培养液3.5ml制成细胞悬液，以5.6×107/ml的细胞密度接种于25ml的塑料培养瓶中，在饱和湿度、37℃、5％CO2孵育培养箱内培养10天后，贴壁细胞长满程度达90％，采用0.25％的胰酶消化1分钟，用含15％胎牛血清的DMEM培养液终止消化。
3、骨髓神经组织定向干细胞的筛选、纯化上述培养瓶中细胞经15％胎牛血清的DMEM培养液终止消化后，换用含2％B27(GIBCO公司)、1％N2(GIBCO公司)、20ng/mlbFGF(CytoLab公司)、20ng/mlEGF(GIBCO公司)的DMEM/F12无血清培养液5ml，机械吹打贴壁细胞，使细胞重悬，细胞密度为8.6×106个/ml，在饱和湿度、37℃、5％CO2培养箱内培养6天后出现细胞球，经鉴定为骨髓神经组织定向干细胞。待细胞球生长到数十个细胞时，在镜下挑选其中一个较大的细胞球，用10μl的移液枪头吸出放入培养皿中，机械吹打，用上述的DMEM/F12无血清培养液进行单克隆培养，待再次形成的各细胞球较大时，机械吹打，反复3次扩增细胞，3周后转入25ml的培养瓶中培养，得到单克隆生长的骨髓神经组织定向干细胞。
骨髓神经组织定向干细胞的鉴定方法按常规经免疫组织化学法(详见朱长庚主编，《神经免疫细胞化学》)检测，细胞球呈CXCR4(Santa Cruz公司)阳性、Nestin(Santa Cruz公司)阳性、CD45(Santa Cruz公司)阴性，将细胞球置入6孔培养板中，加入0.8ml含2％B27(GIBCO公司)、1％N2(GIBCO公司)、20ng/mlBDNF(GIBCO公司)的DMEM/F12无血清培养液，细胞球贴壁、分化，细胞呈多突起样、7天后检测分化的细胞，神经元标志性蛋白NSE、NF-200(SantaCruz公司)阳性，确认此细胞球即为骨髓神经组织定向干细胞神经细胞球。
本发明培养方法操作简便，成本低廉，只需取少量骨髓就可以培养得到足够量的骨髓神经组织定向干细胞，细胞可来源于自体，避免了免疫排斥和伦理学等问题。且培养过程中无有毒试剂，不仅有利于环保，也有利于干细胞的稳定及移植的安全。本发明为中枢神经系统疾患的细胞移植治疗及周围神经的修复提供了一种移植用种子细胞的来源途径。
权利要求
1.一种骨髓神经组织定向干细胞的培养方法，包括制备骨髓单核细胞，骨髓单核细胞的贴壁生长、增殖，以及骨髓神经组织定向干细胞的筛选纯化及增殖；其特征在于骨髓单核细胞的贴壁生长、增殖采用的是含15％～20％胎牛血清的DMEM培养液，骨髓神经组织定向干细胞的筛选纯化、增殖采用的是含2％B27、1％N2、20ng/mlbFGF、20ng/mlEGF的DMEM/F12无血清培养液；骨髓神经组织定向干细胞在含2％B27、1％N2、20ng/mlbFGF、20ng/mlEGF的DMEM/F12无血清培养液中悬浮生长，并形成细胞球，选取细胞球进行增殖培养，即得所需的骨髓神经组织定向干细胞。
2.按权利要求1所述的骨髓神经组织定向干细胞的培养方法，其特征在于具体步骤如下(1)制备骨髓单核细胞按常规从新鲜骨髓细胞中分离得到骨髓单核细胞；(2)细胞的增殖培养将上述骨髓单核细胞，用含15％～20％胎牛血清的DMEM培养液制备成细胞悬液，接种于培养瓶中，在5％CO2培养箱内培养，待贴壁细胞长满瓶底时，用0.25％的胰酶消化，再用上述含血清的DMEM培养液终止其消化；(3)骨髓神经组织定向干细胞的筛选、纯化上述培养瓶中细胞经15％～20％胎牛血清的DMEM培养液终止消化后，换用含2％B27、1％N2、20ng/mlbFGF、20ng/mlEGF的DMEM/F12无血清培养液制成细胞悬液，在5％CO2培养箱内培养至细胞球出现，取一个较大的细胞球，用上述DMEM/F12无血清培养液制成细胞悬液继续培养，待形成众多的细胞球时，按上述方法将细胞球再次制备成细胞悬液，如此反复，骨髓神经组织定向干细胞得以增殖，即可得到足够量的骨髓神经组织定向干细胞。
3.权利要求1或2所述培养方法得到的骨髓神经组织定向干细胞。
4.权利要求3所述骨髓神经组织定向干细胞在制备神经修复制剂或组织工程神经中的应用。
全文摘要
本发明涉及生物组织工程技术领域，是一种制备神经修复移植用种子细胞——骨髓神经组织定向干细胞的培养方法。本发明只需少量骨髓，分离到骨髓单核细胞后经增殖培养，再用含2％B27、1％N2、20ng/ml bFGF、20ng/ml EGF的DMEM/F12无血清培养液进行筛选、纯化、培养就可制得足够量的骨髓神经组织定向干细胞。本发明操作简便、成本低廉，得到的骨髓神经组织定向干细胞稳定、安全，且可来源于自体，避免了免疫排斥和伦理学等问题。本发明为中枢神经系统疾患的细胞移植治疗及周围神经的修复提供了一种移植用种子细胞的来源途径。
文档编号C12N5/08GK1974764SQ20061011943
公开日2007年6月6日 申请日期2006年12月12日 优先权日2006年12月12日
发明者张志英, 张传森, 任丛莉 申请人:中国人民解放军第二军医大学