专利名称：：携带与l-肉碱生物合成相关基因的肠杆菌科属微生物和使用该微生物生产l-肉碱的方法
技术领域：
：本发明涉及包括来源于粗糙脉孢菌(A^"ra^omcra^a)的L-肉碱生物合成相关基因的肠杆菌科(五^erak^en'acfle)的微生物，和使用所述微生物生产L-肉碱的方法。
背景技术：
：L-肉碱(3-羟基-4-三甲基氨基丁酸)在生物体中普遍存在，并且是在线粒体中将活化的长链脂肪酸经由线粒体内膜携带到线粒体基质中的两性离子化合物。已知在人体中L-肉碱可以从赖氨酸或蛋白质赖氨酸合成。在哺乳动物中，蛋白质赖氨酸通常用作L-肉碱生物合成的前体，然而，在粗糙脉孢菌中，应用游离的赖氨酸。在L-肉碱的生物合成中，形成s-N,N，N-三甲基赖氨酸，s-N,N，N-三甲基-(3-羟基赖氨酸，N，N，N-三甲基氨基丁醛中间体，和Y-丁酰甜菜碱，并且Y-丁酰甜菜碱通过Y-丁酰甜菜碱羟化酶羟基化而成为L-肉碱。图1是图解粗糙脉孢菌中假定的L-肉碱生物合成途径的流程图。L-肉碱可以通过化学合成法、应用酶反应的半合成法、和应用微生物的方法生产。然而，当应用化学合成法时，存在问题，即获得DL-肉碱外消旋混合物，由此必须分离DL-外消旋混合物。作为应用酶反应的半合成法的一个实例，美国专利号4,221,869公开了使用应用NAD作为辅酶的肉碱脱氢酶(EC1丄U08)，由脱氢肉碱生产L-肉碱的方法。然而，脱氢肉碱极其不稳定并自发分解为丙酮基三甲铵和二氧化碳。另外，德国专利号DE-OS-3123975公开了由Y-丁酰甜菜碱生产L-肉碱的方法，该方法使用从粗糙脉孢菌分离的Y-丁酰甜菜碱羟化酶(EC1.14.11.1)。然而，存在一个缺点，即在羟基化期间必须将a-酮戊二酸和还原物(g卩，抗坏血酸)加入反应物中。关于应用微生物生产L-肉碱的方法，例如，美国专利号5,028,538公开了一种从将大肠杆菌(E.coli)044K74培养在含有巴豆酸甜菜碱(4-N,N,N-三乙基氨基巴豆酸)的培养基之后获得的培养物而收集L-肉碱的方法。另外，美国专利号4,708,936公开了通过将木糖氧化产碱菌(^c/zramok^erjc_y/ayox>^ara)DSM3225(HK1331b)培养在含有巴豆酸甜菜碱和/或Y-丁酰甜菜碱的培养基中来生产L-肉碱的方法。然而，存在缺点，即，应该使用L-肉碱生物合成的前体，诸如巴豆酸甜菜碱，或不是中间体的化合物，并且L-肉碱的产率不高。因此，在应用微生物生产L-肉碱的方法中仍然存在提高产率的需要。本发明的发明人己经尝试生产应用廉价前体并且还具有高产率的L-肉碱的微生物，并且发现来源于粗糙脉孢菌与L-肉碱的生物合成相关的基因在肠杆菌科的微生物中充分表达，由此完成本发明。附图描述图1是图解粗糙脉孢菌中假定的L-肉碱生物合成途径的流程图。图2是显示洗脱溶液的天然或SDS-PAGE分析的结果的图，所述洗脱溶液通过裂解粗糙脉孢菌培养物并且对裂解的物质进行DEAE柱层析而获得。图3是显示在将图2的蛋白条带a、b和c与赖氨酸和S-腺苷甲硫氨酸反应后通过HPLC检测三甲基赖氨酸的结果的图表。图4是显示通过HPLC分析通过将条带a蛋白反应而获得的样品、以及三甲基赖氨酸标准物的结果的图表。图5是显示通过PCR扩增LMT基因的电泳结果的图。图6图示pT7-7LMT的产生过程。图7是显示裂解的细菌的上清液SDS-PAGE分析结果的图，所述裂解的细菌通过在IPTG存在下培养含有来源于粗糙脉孢菌的S-腺苷甲硫氨酸-6->^-赖氨酸-甲基转移酶的大肠杆菌并且将从中获得的细菌裂解而获得。图8图示pT7-7TMLH的产生过程。图9图示pT7-7TMLA的产生过程。图10图示pT7-7TMABADH的产生过程。图11图示pT7-7BBH的产生过程。图12是显示分别插入至UpT7-7TMLH、pT7-7TMLA、pT7-7TMABADH和pT7-7BBH中的每一基因的电泳结果的照片。在图12中，泳道1代表标记，泳道2代表pT7-7TMLH，泳道3代表pT7-7TMLA，泳道4代表pT7-7TMABADH，并且泳道5代表pT7-7BBH。图13是显示粗提物的SDS-PAGE结果的照片，所述粗提物分别获自用pT7-7TMLH、pT7-7TMLA、pT7-7TMABADH和pT7-7BBH转化的大肠杆菌BL21(DE3)的培养物。在图13中，泳道1代表标记，泳道2代表阴性对照组，泳道3代表pT7-7TMLH(52kDa)，泳道4代表pT7-7TMLA(53kDa)，泳道5代表pT7-7TMABADH(55kDa)和泳道6代表pT7-7BBH(49kDa)。图14图示pT7-7CarABE的产生过程。图15图示pACYC184CarCD的产生过程。发明详述技术问题本发明提供能够高效率生产L-肉碱的微生物。本发明还提供应用所述微生物生产L-肉碱的方法。技术方案按照本发明的一个方面，提供一种属于肠杆菌科的微生物，所述微生物包含编码来源粗糙脉孢菌的S-腺苷甲硫氨酸-6-N-赖氨酸-甲基转移酶(LMT)活性的多核苷酸；编码3-羟基-6-N-三甲基赖氨酸醛縮酶(TMLA)活性的多核苷酸；编码N-三甲基赖氨酸羟化酶(TMLH)活性的多核苷酸；编码Y-三甲基氨基醛脱氢酶(TMABADH)活性的多核苷酸；和编码Y-丁酰甜菜碱羟化酶(BBH)活性的多核苷酸。按照本发明的微生物可以是含有编码所述5种蛋白的多核苷酸的任一种。优选地，所述微生物是大肠杆菌(^c/zen'c&aco/0，并且更优选大肠杆菌(保藏号KCCM-10638)。按照本发明独立编码5种蛋白，即，lmt、tmlh、tmla、tmabadh和bbh的多核苷酸可以通过载体或其本身用于微生物。当独立编码所述5种蛋白的多核苷酸通过载体用于微生物时，可以将编码所述5种蛋白的多核苷酸插入到单一载体中尔后应用，或者可以插入到至少一种载体中尔后应用。在本发明中，术语"载体"是本领域的技术人员公知的。载体通常是指用于将核酸引入细胞的核酸构建体。这一核酸构建体可以是衍生于质粒或病毒基因组的核酸构建体。按照本发明的一个实施方案编码来源于粗糙脉孢菌的s-腺苷甲硫氨酸-6-n-赖氨酸-甲基转移酶(lmt)的多核苷酸编码来源于粗糙脉孢菌的s-腺苷甲硫氨酸赖氨酸甲基转移酶D认为s-腺苷甲硫氨酸赖氨酸甲基转移酶在粗糙脉孢菌细胞中催化通过将甲基基团附着到赖氨酸上而将赖氨酸转化成为6-n-三甲基赖氨酸的反应，但是本发明的范围不限于这一具体的作用机制。编码s-腺苷甲硫氨酸赖氨酸甲基转移酶的多核苷酸优选地是编码氨基酸序列seqidno:11的多核苷酸，并且更优选地是具有核苷酸序列seqidno:16的多核苷酸。按照本发明的一个实施方案编码来源于粗糙脉孢菌的n-三甲基赖氨酸羟化酶(tmlh)的多核苷酸编码来源于粗糙脉孢菌的n-三甲基赖氨酸羟化酶(tmlh)。认为n-三甲基赖氨酸羟化酶(tmlh)在粗糙脉孢菌细胞中催化将N-三甲基赖氨酸转化成P-羟基-s-N-三甲基赖氨酸的反应，但是本发明的范围不限于这一具体的作用机制。编码n-三甲基赖氨酸羟化酶(tmlh)的多核苷酸优选地是编码氨基酸序列seqidno:12的多核苷酸，并且更优选的是具有核苷酸序列seqidno:17的多核苷酸。按照本发明的一个实施方案编码来源于粗糙脉孢菌的3-羟基-6-N-三甲基赖氨酸醛縮酶(tmla)的多核苷酸编码来源于粗糙脉孢菌的3-羟基-6-:^-三甲基赖氨酸醛缩酶0^1^)。认为3-羟基-6-n-三甲基赖氨酸醛縮酶(tmla)在粗糙脉孢菌细胞中催化将(3-羟基-s-N-三甲基赖氨酸转化成y-N-三甲基氨基丁醛的反应，但是本发明的范围不限于这一具体的作用机制。编码3-羟基-6-n-三甲基赖氨酸醛缩酶(tmla)的多核苷酸优选地是编码氨基酸序列seqidno:13的多核苷酸，并且更优选的是具有核苷酸序列seqidno:18的多核苷酸。按照本发明的一个实施方案编码来源于粗糙脉孢菌的，三甲基氨基醛脱氢斷TMABADH)活性的多核苷酸编码来源于粗糙脉孢菌的，三甲基氨基醛脱氢酶(TMABADH)活性。认为y-三甲基氨基醛脱氢酶(TMABADH)在粗糙脉孢菌细胞中催化将Y-N-三甲基氨基丁醛转化成Y-丁酰甜菜碱的反应，但是本发明的范围不限于这一具体的作用机制。编码Y-三甲基氨基醛脱氢酶(TMABADH)的多核苷酸优选地是编码氨基酸序列SEQIDNO:14的多核苷酸，并且更优选的是具有核苷酸序列SEQIDNO:19的多核苷酸。按照本发明的一个实施方案编码来源于粗糙脉孢菌的Y-丁酰甜菜碱羟化酶(BBH)活性的多核苷酸编码来源于粗糙脉孢菌的Y-丁酰甜菜碱羟化酶(BBH)。认为Y-丁酰甜菜碱羟化酶(BBH)在粗糙脉孢菌细胞中催化将丁酰甜菜碱转化成L-肉碱的反应，但是本发明的范围不限于这一具体的作用机制。编码Y-丁酰甜菜碱羟化酶(BBH)的多核苷酸优选地是编码氨基酸序列SEQIDNO:15的多核苷酸，并且更优选地是具有核苷酸序列SEQIDNO:20的多核苷酸。按照本发明的另一个方面，提供生产L-肉碱的方法，所述方法包括在底物存在下，培养按照本发明的微生物，以在培养物中生产L-肉碱，所述底物选自由下列各项组成的组L-赖氨酸，N-三甲基赖氨酸，P-羟基-N-三甲基赖氨酸,Y-N-三甲基氨基丁醛,Y-丁酰甜菜碱，及其混合物。在按照本发明生产L-肉碱的方法中，选自由L-赖氨酸、N-三甲基赖氨酸、(3-羟基-N-三甲基赖氨酸、Y-N-三甲基氨基丁醛、Y-丁酰甜菜碱及其混合物组成的组的底物的浓度优选地为基于培养基重量的0.1-10重量％，但是本发明并不特别限于这一范围。在按照本发明的方法中，从培养物收集L-肉碱的方法是本领域的技术人员公知的。这样的方法的实例包括，但不限于，超滤、离心分离、和在将细胞从培养物分离后得到的产物重结晶而收集L-肉碱的方法诸如倾析法，并且对于从中获得的上清液进行阳离子交换层析或电渗析。有利效果按照本发明的微生物具有生产L-肉碱的良好能力，以致它可以有效用于通过发酵生产L-肉碱的方法。在按照本发明生产L-肉碱的方法中，使用属于肠杆菌科的微生物可以高效地生产L-肉碱。最佳方式以下，将参考下列实施例更具体地描述本发明。这些实施例仅是为了举例说明目的并不是意图限制本发明的范围。实施例产生编码在粗糙脉孢菌中与由L-赖氨酸生物合成L-肉碱相关的5种蛋白的多核苷酸，以及包含其的核酸构建体。接着，用所述核酸构建体转化大肠杆菌，并且将转化的大肠杆菌在含有通过L-肉碱生产途径获得的中间产物的培养基中培养，以生产L-肉碱并且收集L-肉碱。实施例1:分离编码来源于粗糙脉孢菌的LMT、TMLH、TMLA、TMABADH和BBH的多核苷酸分离并且克隆来源于粗糙脉孢菌的编码LMT、TMLH、TMLA、TMABADH和BBH的多核苷酸，并且分析其碱基序列。(1)制备粗糙脉孢菌的cDNA文库从包含粗糙脉孢菌真菌体(包括孢子体)的培养物分离总mRNA，并且使用polyT作为引物进行反转录，然后进行PCR扩增cDNA。将扩增的cDNA用￡co/I禾卩扇oI消化，然后将消化的cDNA插入到人AD5克隆载体的I和屈oI位点，以制备来源于粗糙脉孢菌的cDNA文库。接着，将所述cDNA文库感染大肠杆菌BNN322，然后培养并且扩增感染的大肠杆菌BNN322。首先，将大肠杆菌BNN322在含有50|ag/ml卡那霉素和0.2%麦芽糖的LB培养基中培养过夜。然后，对于从其获得的培养物进行离心分离，然后去除得到的产物的上清液，并且之后将细胞沉淀重悬在1ml10mMMgS04溶液中。将从得到的产物获得的混悬液与5X107PFU的XcDNA文库在3(TC不振荡地温育30分钟，向培养物中另外加入2mlLB培养基，并且接着将得到的培养物在3CTC在振荡培养箱中振荡1个小时。将培养的细胞划线到含有氨苄青霉素(75吗/ml)的LB培养平板上，并且在37'C培养8小时。使用Wizard试剂盒从平板的菌落分离cDNA文库集合(cDNAlibrarypool)。将包含分离的cDNA文库集合的人用作模板，以扩增编码LMT、TMLH、TMLA、TMABADH和BBH的多核苷酸。(2)扩增并且克隆编码LMT的多核苷酸(LMT基因)并且证实LMT生产(a)从粗糙脉孢菌分离LMT基因并且证实所述基因的功能性表达培养粗糙脉孢菌并且收集细胞。然后，使用含有2mMDTT和0.2mMEDTA的lMpH7.4的磷酸钾缓冲液将细胞裂解，然后提取蛋白。将硫酸铰缓慢加入到所获得的上清液中，达到50%终饱和浓度而将蛋白沉淀下来，然后向通过离心沉淀的蛋白加入少量0.1MpH7.4的磷酸钾缓冲液。将得到的溶液使用Tl透析膜进行脱盐，并且将脱盐的样品使用DEAE柱纯化。在此时，使用0.1MpH7.4的磷酸钾缓冲液作为洗涤缓冲液和包含0.3MNaCl的0.1MpH7.4的磷酸钾缓冲液作为洗脱缓冲液而进行合并(pooling)。此后，将合并的样品使用T1透析膜脱盐。脱盐样品使用CM柱纯化。将0.1MpH7.4的磷酸钾缓冲液用作所述柱的洗漆缓冲液，并且将没有吸附到柱上并且从柱上流出的样品都合并起来。将蛋白样品再次加载到DEAE柱上，然后使用0.1MpH7.4的磷酸钾缓冲液，进行密度梯度洗脱，达到0-0.3M的NAC1浓度。使用天然-PAGE和SDS-PAGE对纯化的样品进行蛋白质分析。图2是显示洗脱溶液的天然-PAGE或SDS-PAGE分析的结果的图，所述洗脱的溶液在将粗糙脉孢菌培养物裂解并且对所裂解的物质进行DEAE柱层析之后获得。在图2中，泳道1代表标记，泳道2和3代表DEAE洗脱峰2的天然-PAGE分析的结果，并且泳道4和5代表DEAE洗脱峰3的天然-PAGE分析的结果。在图2B中，泳道1代表标记，泳道2代表DEAE洗脱峰2的天然-PAGE分析的结果，泳道3代表DEAE洗脱峰3的天然-PAGE分析的结果，泳道4和5代表DEAE洗脱峰2的SDS-PAGE分析的结果，并且泳道6和7代表DEAE洗脱峰3的SDS-PAGE分析的结果。从图2的结果，将条带a、b和c选作LMT候选蛋白，并且测量每一蛋白的活性。首先，将与每一条带对应的凝胶切下，然后用匀浆器将凝胶压碎。然后，向其中加入5mllg/L赖氨酸(终浓度500mg/L)和2mllg/L甲基供体，S-腺苷甲硫氨酸(终浓度200mg/L)，并且将得到的产物在28。C缓慢搅拌24小时进行反应，然后使用HPLC分析三甲基赖氨酸峰。图3是显示在蛋白条带a、b和c与赖氨酸和S-腺苷甲硫氨酸反应后通过HPLC测量三甲基赖氨酸的结果的图表。如在图3中所示，在与条带a反应的样品中，在大约15分钟的停留时间证实为被视为三甲基赖氨酸的峰。在图3中，1、2和3代表与每一条带a、b和c相对应的结果。为了准确地证实所述条带，将通过与条带a的反应获得的样品与三甲基赖氨酸标准物进行比较。图4是显示通过HPLC分析通过与蛋白条带a反应获得的样品和三甲基赖氨酸标准物的结果的图表。如在图4中所示，条带a的峰时，g口，电压具有最高值的时间，与标准三甲基赖氨酸样品完全一致。因此，证实条带a包括S-腺苷甲硫氨酸-6-N-赖氨酸-甲基转移酶，LMT。在图4中，1和2是指分别与标准物和条带a相对应的结果。图2和3的每一图表是独立的HPLC图表整合在其中的图表。接下来，分析N-端序列，以获得LMT蛋白的氨基酸序列。首先，将在SDS-PAGE凝胶上的蛋白转移到PVDF膜上，然后将蛋白条带切下，以通过Edman方法分析N-端序列。特别地，异硫氰酸苯酯(PTC)与肽在pH值8-9和室温反应，因此获得其中N-端被硫代氨甲酰化的PTC-肽。然后，将PTC-肽在酸性条件下反应，以从中仅分离的N-端氨基酸。分离的氨基酸用乙酸乙酯提取，用HPLC鉴定，并且分析。结果，证实N-端序列为AFGKL(SEQIDNO:21)。与此相似，基于所证实的N-端氨基酸序列进行关于己知的粗糙脉孢菌的完整的基因组序列的探寻。结果，证实具有与LMT的N-端序列一致的氨基酸序列的蛋白和基因、以及核苷酸序列。(b)携带LMT基因的表达载体和微生物生产收集培养的粗糙脉孢菌，并且使用液氮裂解，然后使用RNA纯化试剂盒纯化RNA。应用关于在(a)中证实的LMT的氨基酸和碱基序列的信息而生产SEQIDNOS:l和2的引物，然后，使用在(1)中产生的cDNA文库，通过使用所述引物对作为引物的PCR而扩增S-腺苷甲硫氨酸-6-N-赖氨酸-甲基转移酶基因(图5)。图5是显示通过PCR扩增的LMT基因的电泳结果的图。将获得的PCR产物和pT7-7载体分别用NdeI和BamHI消化，并且使用T4DNA连接酶彼此连接，以产生pT7-7LMT载体(图6)。图6图示pT7-7LMT的产生过程。应用电穿孔用pT7-7LMT载体转化大肠杆菌BL21DE3。将40(il的大肠杆菌BL21DE3和1|al的pT7-7LMT载体混和，置于具有2mm缝隙的冰冷的小杯中，并且在2.5kV,200q，和25jiF的条件下通过电穿孔进行转化。将获得的转化体划线到含有氨苄青霉素的固体平板培养基上，然后将质粒从在其中所选的转化体纯化，并且用A^feI和^w^TI消化。结果，通过证实插入的基因和质粒的大小，而证实pT7-7LMT引入到质粒中；这叫作BL21(DE3)/pT7-7LMT。(c)在大肠杆菌中表达S-腺苷甲硫氨酸-6-N-赖氨酸-甲基转移酶并且从赖氨酸产生三甲基赖氨酸将BL21(DE3)/pT7-7LMT在LB培养基中培养至OD60()0.5，然后在向其中加入1mMIPTG后再培养4小时。对培养物进行离心，并且收集细胞并使用超声波裂解。通过对细胞裂解物进行SDS-PAGE，证实约25kD的S-腺苷甲硫氨酸-6-N-赖氨酸-甲基转移酶(图7)。图7是显示上清液的SDS-PAGE分析结果的图，其中所述上清液通过在IPTG存在下培养含有来源于粗糙脉孢菌的S-腺苷甲硫氨酸-6-N-赖氨酸-甲基转移酶的大肠杆菌并且将从中获得的微生物裂解而获得。在图7中，泳道M是指标记，泳道1是指阴性对照组，泳道2和3是指细胞裂解物，并且泳道2和3中的环形部分是指在25kD位置与LMT相对应的条带。将大肠杆菌BL21(DE3)/pT7-7LMT在其中置有含有50ml氨苄青霉素的LB培养基的装有挡板的250ml烧瓶中培养至0D6。Q0.6，然后在向其中加入lmMIPTG后，在28。C再培养超过8小时，以形成酶的正确的三级结构，并且防止内含体的形成。在培养过程中，加入500mg/L的L-赖氨酸和200mg/L的S-腺苷甲硫氨酸作为反应溶液，并且测量培养溶液中的三甲基赖氨酸含量。结果在表1中显示。在下述条件下通过HPLC测量三甲基赖氨酸。来源于Supelco的SUPELCOSILLC-DABS用作柱。A缓冲液这样制备，以致将0.1%的三氟乙酸(TFA)加入到其中蒸馏水和乙腈以2:8比例混和的缓冲液中，并且B缓冲液这样制备，以致将0.1X的TFA加入到其中蒸馏水和乙腈以2:8的比例混和的缓冲液中。使用线性浓度梯度方法，保持0.8ml/min的流速，分析三甲基赖氨酸。表l.测定的物质三甲基赖氨酸(pg/ml)大肠杆菌BL21(DE3)/pT7-7(IPTG诱导)+500mg/L赖氨酸+200mg/LAdo-Met0.0大肠杆菌BL21(DE3)/pT7-7LMT(IPTG诱导)+500mg/L赖氨酸+200mg/LAdo-Met20.0如在表1中所示，证实来源于粗糙脉孢菌的S-腺苷甲硫氨酸-6-N-赖氨酸-甲基转移酶的基因在大肠杆菌中表达，并且从中将L-赖氨酸转化成三甲基赖氨酸。(3)扩增并且克隆编码TMLH的多核苷酸(TMLH基因)，并且证实TMLH的产生(a)扩增并且克隆编码TMLH的多核苷酸(TMLH基因)使用包含(l)的cDNA文库集合的;M乍为模板，并且使用SEQIDNOS:3和4作为引物进行PCR。然后，对于获得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。结果，证实约1.4kb的需要产物。SEQIDNOS:3和4的引物包括假定编码来源于粗糙脉孢菌的TMLH的起始密码子和终止密码子的序列。通过在从粗糙脉孢菌基因组表达的全蛋白的氨基酸序列和来源于人和大鼠的已知的TMLH的氨基酸序列之间进行同源性搜索而搜索来源于粗糙脉孢菌的潜在的TMLH，从潜在的TMLH的氨基酸序列设计SEQIDNOS:3和4的引物。将PCR产物用EcoRI和Sail消化，并且与用相同的酶消化的pBSKS+(StratageneInc.)连接，然后将大肠杆菌DH5a用其中插入所获得的PCR产物的pBSKS+(TMLH)转化。将转化的大肠杆菌DH5ot在37°。培养8小时，然后分离pBSKS+(TMLH)，并且用EcoRI和Sall消化，以确定PCR产物是否正确插入。接着，将分离的pBSKS+(TMLH)用Ndel和Sail消化，然后在琼脂糖凝胶电泳之后将NdeI和SalI片段分离。将所述片段与用相同的酶消化的表达载体pT7-7连接，以获得pT7-7TMLH(参见图8)。将pT7-7(TMLH)转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。(b)证实TMLH产生将用获得的pT7-7(TMLH)转化的大肠杆菌BL21(DE3)在37"C在其中置有含有100吗/ml氨苄青霉素的50mlLB培养基的装有挡板的250ml烧瓶中培养至OD6oo0.6，并且在向其中加入1mMIPTG之后继续培养4个小时。将pT7-7(TMLH)从培养物分离，并且用Ndel和Sall消化，然后进行琼脂糖凝胶电泳。结果在图12中显示。如在图12中所示，证实与Ndel和Sail片段相对应的条带(泳道2)。接着，分离pT7-7(TMLH)，并且分析TMLH的核苷酸序列。结果，TMLH的核苷酸序列证实是与在NCBI的粗糙脉孢菌基因组数据库中保存的序列相同的序列(SEQIDNO:17)。另外，在用pT7-7(TMLH)转化的大肠杆菌BL21(DE3)的培养物中证实表达的TMLH蛋白。首先，在4,000xg离心15分钟对培养物进行离心分离，并且收集细胞沉淀。向获得的细胞沉淀中加入1ml的裂解缓冲液(140mMNaCl，200gA甘油和lmMDTT，在10mMpH7.4的磷酸钠缓冲溶液中)并且重悬。将细胞混悬液置于冰浴中，并且通过传送超声波5次每次IO秒而将细胞使用超声破碎器裂解。对细胞裂解物进行离心分离，在4。C，10,000g离心20-30分钟，然后去除细胞碎片，并且收集上清液以获得细胞粗提物。通过收集来源于获得的细胞粗提物的样品而进行8%SDS-PAGE(参见图13，泳道2)。作为进行SDS-PAGE的结果，证实与TMLH相对应的约52kDa的条带。(3)扩增并且克隆编码3-羟基-6-N-三甲基赖氨酸醛缩酶(TMLA)的多核苷酸并且证实TMLA的产生(a)扩增并且克隆编码3-羟基-6-N-三甲基赖氨酸醛縮酶(TMLA)的多核苷酸使用包含(1)的cDNA文库集合的入作为模板，并且使用SEQIDNOS:5和6作为引物进行PCR。然后，对于获得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。结果，证实约1.4kb的需要产物。SEQIDNOS:5和6的引物包括编码来源于粗糙脉孢菌的TMLA的起始密码子和终止密码子的序列。通过在从粗糙脉孢菌基因组表达的全蛋白的氨基酸序列和来源于人和大鼠的已知的TMLA的氨基酸序列之间进行同源性搜索而搜索来源于粗糙脉孢菌的潜在的TMLA，从潜在的TMLA的氨基酸序列设计引物SEQIDNOS:5禾口6。将PCR产物用EcoRI和Sail消化，并且与用相同的酶消化的pBSKS+(StratageneInc.)连接，然后将大肠杆菌DH5a用其中插入所获得的PCR产物的pBSKS+(TMLA)转化。将转化的大肠杆菌DH5a在37'C培养8小时，然后从中分离pBSKS+(TMLA)，并且用EcoRI和Sail消化，以确定PCR产物是否正确插入。接着，将分离的pBSKS+(TMLA)用Ndel和Sail消化，然后在琼脂糖凝胶电泳之后将Ndel和Sail片段分离。将所述片段与用相同的酶消化的表达载体pT7-7连接，以获得pT7-7(TMLA)(参见图9)。将大肠杆菌BL21(DE3)用pT7-7(TMLA)转化。(b)证实TMLA产生将用获得的pT7-7(TMLA)转化的大肠杆菌BL21(DE3)在37。C在其中置有含有100吗/ml氨苄青霉素的50mlLB培养基的装有挡板的250ml烧瓶中培养至OD6oo0.6，并且在向其中加入ImMIPTG之后继续培养4个小时。将pT7-7(TMLA)从培养物分离，并且用Ndel和Sail消化，然后进行琼脂糖凝胶电泳。结果在图12中显示。如在图12中所示，证实与Ndel和Sail片段相对应的条带(泳道3)。接着，分离pT7-7(TMLA)，并且分析TMLA的核苷酸序列。结果，TMLA的核苷酸序列证实是与在NCBI的粗糙脉孢菌基因组数据库中保存的序列相同的序列(SEQIDNO:18)。另外，在用pT7-7(TMLA)转化的大肠杆菌BL21(DE3)的培养物中证实表达的TMLA蛋白。首先，在4,000xg离心15分钟对培养物进行离心分离，并且收集细胞沉淀。向获得的细胞沉淀中加入lml的裂解缓冲液(140mMNaCl,200g/l甘油和lmMDTT，在10mMpH7.4的磷酸钠缓冲溶液中)并且重悬。将细胞混悬液置于冰浴中，并且通过传送超声波5次每次10秒而将细胞使用超声破碎器裂解。对细胞裂解物进行离心分离，在4。C，10,000g离心20-30分钟，然后去除细胞碎片，并且收集上清液以获得细胞粗提物。通过收集来源于获得的细胞粗提物的样品而进行8%SDS-PAGE(参见图13，泳道3)。作为进行SDS-PAGE的结果，证实与TMLA相对应的约53kDa的条带。(4)扩增并且克隆编码Y-三甲基氨基醛脱氢酶(TMABADH)的多核苷酸并且证实TMABADH的产生(a)扩增并且克隆编码Y-三甲基氨基醛脱氢酶(TMABADH)的多核苷酸使用包含(1)的cDNA文库集合的"乍为模板，并且使用SEQIDNOS:7和8作为引物进行PCR。然后，对于获得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。结果，证实约1.5kb的需要产物。SEQIDNOS:7和8的引物包括编码来源于粗糙脉孢菌的TMABDH的起始密码子和终止密码子的序列。通过在从粗糙脉孢菌基因组表达的全蛋白的氨基酸序列和来源于人和大鼠的已知的TMABADH的氨基酸序列之间进行同源性搜索而搜索来源于粗糙脉孢菌的潜在的TMABADH，并且从潜在的TMABADH的氨基酸序列设计引物SEQIDNOS:7和8。将PCR产物用EcoRI和Sail消化，并且与用相同的酶消化的pBSKS+(StratageneInc.)连接，然后将大肠杆菌DH5a用其中插入所获得的PCR产物的pBSKS+(TMABADH)转化。将转化的大肠杆菌DH5a在37。C培养8小时，然后从中分离pBSKS+(TMABADH)，并且用EcoRI和Sail消化，以确定PCR产物是否正确插入。接着，将分离的pBSKS+(TMABADH)用Ndel和SalI消化，然后在琼脂糖凝胶电泳之后将NdeI和Sail片段分离。将所述片段与用相同的酶消化的表达载体pT7-7连接，以获得pT7-7(TMABADH)(参见图10)。将大肠杆菌BL21(DE3)用pT7-7(TMABADH)转化。(b)证实TMABADH产生将用获得的pT7-7(TMABADH)转化的大肠杆菌BL21(DE3)在37'C在其中置有含有氨节青霉素的50mlLB培养基的装有挡板的250ml烧瓶中培养至OD6。。0.6，并且在向其中加入1mMIPTG之后继续培养4个小时。将pT7-7(TMABADH)从培养物分离，并且用Ndel和Sail消化，然后进行琼脂糖凝胶电泳。结果在图12中显示。如在图12中所示，证实与Ndel禾卩Sail片段相对应的条带(泳道4)。接着，分离pT7-7(TMABADH)，并且分析TMLH的核苷酸序列。结果，TMABADH的核苷酸序列证实是与在NCBI的粗糙脉孢菌基因组数据库中保存的序列相同的序列(SEQIDNO:19)。另夕卜，在用pT7-7(TMABADH)转化的大肠杆菌BL21(DE3)的培养物中证实表达的TMABADH蛋白。首先，对培养物进行离心分离，在4,000xg离心15分钟，并且收集细胞沉淀。向获得的细胞沉淀中加入1ml的裂解缓冲液(140mMNaCl,200g/1甘油和lmMDTT，在10mMpH7.4的磷酸钠缓冲溶液中)并且重悬。将细胞混悬液置于冰浴中，并且通过传送超声波5次每次10秒而将细胞使用超声破碎器裂解。对细胞裂解物进行离心分离，在4。C，10,000g离心20-30分钟，然后去除细胞碎片，并且收集上清液以获得细胞粗提物。通过收集来源于获得的细胞粗提物的样品而进行8%SDS-PAGE(参见图13)。作为进行SDS-PAGE的结果，证实与TMABADH相对应的约55kD的条带。(5)扩增并且克隆编码Y-丁酰甜菜碱羟化酶(BBH)的多核苷酸并且证实BBH的产生(a)扩增并且克隆编码Y-丁酰甜菜碱羟化酶(BBH)的多核苷酸使用包含(1)的cDNA文库集合的X作为模板，并且使用SEQIDNOS:9和IO作为引物进行PCR。然后，对于获得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。结果，证实约1.3kb的需要产物。SEQIDNOS:9和10的引物包括假定编码来源于粗糙脉孢菌的BBH的起始密码子和终止密码子的序列。通过在从粗糙脉孢菌基因组表达的全蛋白的氨基酸序列和来源于人和大鼠的已知的BBH的氨基酸序列之间进行同源性搜索而搜索来源于粗糙脉孢菌的潜在的BBH，并且从潜在的BBH的氨基酸序列设计引物SEQIDNOS:9和10。将PCR产物用EcoRI和Sail消化，并且与用相同的酶消化的pUC19连接，然后将大肠杆菌DH5a用其中插入所获得的PCR产物的pUC19(BBH)转化。将转化的大肠杆菌DH5a在包含100吗/ml氨苄青霉素的LB培养基中在37。C培养8小时，然后从中分离pUC19(BBH)，并且用EcoRI和Sail消化，以确定PCR产物是否正确插入。接着，将分离的pUC19(BBH)用Ndel和Sail消化，然后在琼脂糖凝胶电泳之后将Ndel和Sail片段分离。将所述片段与用相同的酶消化的表达载体pT7-7连接，以获得pT7-7(BBH)(参见图11)。将大肠杆菌BL21(DE3)用pT7-7(BBH)转化。将用获得的pT7-7(BBH)转化的大肠杆菌BL21(DE3)在37"在其中置有含有100吗/ml氨苄青霉素的50mlLB培养基的装有挡板的250ml烧瓶中培养至OD6。o0.6，并且在向其中加入1mMIPTG之后继续培养4个小时。将pT7-7(BBH)从培养物分离，并且用Ndel和Sail消化，然后进行0.8%的琼脂糖凝胶电泳。结果在图12中显示。如在图12中所示，证实与Ndel和Sail片段相对应的条带(泳道5)。接着，分离pT7-7(BBH)，并且分析BBH的核苷酸序列。结果，BBH的核苷酸序列证实是与在NCBI的粗糙脉孢菌基因组数据库中保存的序列相同的序列(SEQIDNO:20)。(b)证实BBH蛋白的产生在用pT7-7(BBH)转化的大肠杆菌BL21(DE3)的培养物中证实表达的BBH蛋白。首先，在4,000xg离心15分钟，对培养物进行离心分离，并且收集细胞沉淀。向获得的细胞沉淀中加入1ml的裂解缓冲液(140mMNaCl,200g/l甘油和lmMDTT，在10mMpH7.4的磷酸钠缓冲溶液中)并且重悬。将细胞混悬液置于冰浴中，并且通过传送超声波5次每次10秒而将细胞使用超声破碎器裂解。对细胞裂解物进行离心分离，在4°C，10,000g离心20-30分钟，然后去除细胞碎片，并且收集上清液以获得细胞粗提物。通过收集来源于获得的细胞粗提物的样品而进行8。％SDS-PAGE(参见图13，泳道5)。作为进行SDS-PAGE的结果，证实与BBH相对应的约49kDa的条带。实施例2:产生包含所有的LMT、TMLH、TMLA、TMABADH和BBH基因的宿主细胞扩增来源于在实施例1中产生的粗糙脉孢菌cDNA文库的LMT、TMLH和BBH基因，并且产生具有所有这三种基因的pT7-7ABE。另夕卜，产生来自实施例1中产生的粗糙脉孢菌cDNA文库的TMLA和TMABADH基因，并且产生具有所有这两种基因的pACYC184-CarCD。将所产生的pT7-7-CarABE和pACYC184-CarCD用于大肠杆菌，以产生具有所有的LMT、TMLH、TMLA、TMABADH和BBH基因的转化的微生物。将所转化的微生物叫做大肠杆菌BL21(DE3)CJ2004-2，并且于2004年12月13日保藏在韩国微生物保藏中心(KoreanCultureCenterofMicroorganisms,KCCM)，一个国际保藏机构(保藏号KCCM-10638)。(1)产生具有所有三种基因LMT、TMLH和BBH的PT7-7-CarABE首先，使用来源于粗糙脉孢菌的cDNA文库作为模板，并且使用SEQIDNOS:1和2的寡核苷酸作为引物，从T7启动子扩增包含终止密码子的lmt。接着，使用来源于粗糙脉孢菌的cDNA文库作为模板，并且使用SEQIDNOS:3和4的寡核苷酸作为引物，从T7启动子扩增包含终止密码子的TMLH。然后，使用寡核苷酸SEQIDNOS:9和10作为引物，从T7启动子扩增包含终止密码子的BBH。将LMT、TMLH和BBH的扩增产物引入到pT7-7中。首先，将BBH的扩增产物用限制性酶诸如BamHI和SalI消化，并且从中获得BamHI和SalI片段，然后，将所述片段与用相同的酶消化的pT7-7连接，以获得pT7-7BBH。接着，将TMLH的扩增产物用NdeI和EcoRl消化，并且从中获得NdeI和EcoRI片段，然后，将所述片段与用相同的酶消化的pT7-7BBH连接，以获得pT7-7CarBE。然后，将LMT的扩增产物用ClaI消化，并且从中获得ClaI片段，然后，将所述片段与用相同的酶消化的lmt连接，以获得pT7-7CarABE(参见图14)。(2)产生具有所有基因TMLA和TMABADH的pACYC184CarCD首先，使用来源于粗糙脉孢菌的cDNA文库作为模板，并且使用SEQIDNOS:5和6的寡核苷酸作为引物，从T7启动子扩增包含终止密码子的TMLA。接着，使用来源于粗糙脉孢菌的cDNA文库作为模板，并且使用SEQIDNOS:7和8的寡核苷酸作为引物，从T7启动子扩增包含终止密码子的TMABADH。将TMLA禾BTMABADH的扩增产物引入到pACYC184中。首先，将TMLA的扩增产物用BamHI和HindIII消化，并且从中获得Bamffl和Hindm片段，然后，将所述片段与用相同的酶消化的pACYC184连接，以获得pACYC184TMLA。接着，将TMABADH的扩增产物用BamHI和Sail消化，并且从中获得BamHI和Sail片段，然后，将所述片段与用相同的酶消化的pACYC184TMLA连接，以获得pACYC184CarCD。实施例3:使用包含编码LMT、TMLH、TMLA、TMABADH和BBH的多核苷酸的微生物生产L-肉碱将其中弓I入在实施例2中产生的pT7-7-CarABE和pACYC184-CarCD二者的大肠杆菌BL21(DE3)在含有L-赖氨酸的培养基中培养，并且测量L-肉碱的产量。pT7-7-CarABE禾卩pACYC184-CarCD引入大肠杆菌BL21(DE3)应用如实施例1所述的电穿孔进行。(1)通过培养用在实施例2中产生的。T7-7-CarABE和pACYC184-CarCD二者转化的大肠杆菌BL21(DE3)而生产L-肉碱首先，将用pT7-7-CarABE和pACYC184-CarCD二者转化的大肠杆菌BL21(DE3)接种在含有氨节青霉素(100吗/ml)和氯霉素(50吗/ml)的LB固体平板培养基中，并且进行培养。将在固体平板培养基上的微生物菌落在含有20mlLB培养基的烧瓶中在37。C培养12小时至OD細1.0，其中所述LB培养基中加入氨苄青霉素(100吗/ml)和氯霉素(50pg/ml)。将0.1ml所培养的微生物的培养物接种到装有挡板的250ml烧瓶中，其中含有具有2mML-赖氨酸的20mlLB培养基，并且接着在37。C培养至OD,0.6。当加入IPTG时，在OD6oo值达到0.6后加入1mMIPTG，然后将微生物继续培养4个小时。将在无L-赖氨酸的LB培养基中培养所述微生物应用上文所述的相同方法用IPTG诱导的组，和在含有L-赖氨酸的LB培养基中培养所述微生物不用IPTG诱导的组，用作对照组。在培养终止后，使用如(1)中相同的方法确定培养物的L-肉碱含量。结果在表2中显示。表2.通过单一培养物生产L-肉碱培养条件浓度(mg/1)LB培养基(IPTG诱导)0含有2mM赖氨酸的LB培养基(无IPTG诱导)0,14含有2mM赖氨酸的LB培养基(IPTG诱导)19.81如表2所示，通过在含有L-赖氨酸的培养基中培养含有编码LMT、TMLH、TMLA、TMABADH和BBH的所有多核苷酸的微生物，能够以高效率生产L-肉碱。另外，在表2中表示的L-肉碱产量之间相互比较，并且证实当在含有赖氨酸的培养基中培养时L-肉碱具有更高的产率。<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>涉及保藏的微生物或其它生物材料的指示(PCT细贝iJ136&)<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>PCR/RO/134表(1998年7月)权利要求1.一种属于肠杆菌科(Enterobacteriacae)属的微生物，所述微生物包含编码来源于粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)的S-腺苷甲硫氨酸-6-N-赖氨酸-甲基转移酶活性的多核苷酸；编码6-N-三甲基赖氨酸羟化酶活性的多核苷酸；编码3-羟基-6-N-三甲基赖氨酸醛缩酶活性的多核苷酸；和编码γ-三甲基氨基醛脱氢酶活性的多核苷酸与编码γ-丁酰甜菜碱羟化酶活性的多核苷酸。2.权利要求1的微生物，其中所述微生物为大肠杆菌(&c/^Wc/n'fl3.权利要求1的微生物，其中所述微生物为大肠杆菌(保藏号:KCCM-10638)。4.权利要求1的微生物，其中所述编码8-腺苷甲硫氨酸-6-]^-赖氨酸-甲基转移酶(LMT)活性的多核苷酸是编码SEQIDNO:11的氨基酸序列的多核苷酸。5.权利要求1的微生物，其中所述编码6-N-三甲基赖氨酸羟化酶(TMLH)活性的多核苷酸是编码SEQIDNO:12的氨基酸序列的多核苷酸。6.权利要求1的微生物，其中所述编码3-羟基-6-N-三甲基赖氨酸醛縮酶(TMLA)活性的多核苷酸是编码SEQIDNO:13的氨基酸序列的多核苷酸。7.权利要求1的微生物，其中所述编码Y-三甲基氨基醛脱氢酶(TMABADH)活性的多核苷酸是编码SEQIDNO:14的氨基酸序列的多核苷酸。8.权利要求1的微生物，所述编码Y-丁酰甜菜碱羟化酶(BBH)活性的多核苷酸是编码SEQIDNO:15的氨基酸序列的多核苷酸。9.一种生产L-肉碱的方法，所述方法包括在底物的存在下培养权利要求1至权利要求8中任何一项的微生物以在所述培养物中生产L-肉碱，所述底物选自由下列各项组成的组L-赖氨酸，N-三甲基赖氨酸，(3-羟基-N-三甲基赖氨酸，Y-N-三甲基氨基丁酸，"丁酰甜菜碱，及其混合物。10.权利要求9的方法，其中所述底物的浓度为基于培养基重量的O.l至10重量％，所述底物选自由下列各项组成的组L-赖氨酸，N-三甲基赖氨酸，(3-羟基-N-三甲基赖氨酸，Y-N-三甲基氨基丁醛，Y-丁酰甜菜碱，及其混合物。全文摘要本发明提供一种属于肠杆菌科的微生物和应用其生产L-肉碱的方法。所述微生物包含编码来源于粗糙脉孢菌的S-腺苷甲硫氨酸-6-N-赖氨酸-甲基转移酶活性的多核苷酸，编码6-N-三甲基赖氨酸羟化酶活性的多核苷酸，编码3-羟基-6-N-三甲基赖氨酸醛缩酶活性的多核苷酸，和编码γ-三甲基氨基醛脱氢酶与γ-丁酰甜菜碱羟化酶活性的多核苷酸。文档编号C12N1/20GK101213293SQ200680024000公开日2008年7月2日申请日期2006年7月7日优先权日2005年7月7日发明者姜欢求,崔惠真,朱哉映,朴英薰,李炳旭,李真浩,金蕙园,高恩圣申请人:Cj第一制糖株式会社