专利名称：二酯化合物的化学选择性酶水解以制备单酸单酯化合物的方法
技术领域：
本发明涉及从二酯衍生物合成4-羧曱基-2-烷氧基苯曱酸 (4-carboxymethyl-2-alkyloxybenzoic acid )》克基酉旨书亍生4勿的方法。更特别地，是制备4-羧曱基-2-乙氧基苯曱酸乙酯，它是工业生产用于治疗糖尿病的药物活性成分瑞才各列奈 (repaglinide )的关4建合成中间体。瑞格列奈
背景技术：
现有4支术公开的作者为P. MUller等人发表在J. Med. Chem.， 1998, 41 (26), P.5219的文章，其描述了合成4 -羧曱基-2 -乙 氧基苯甲酸，乙酯的方法，其特征是相应二酯衍生物的选4奪性水解 反应。
选4奪性水解反应是在乙醇中在25。C并有强石威，例如氢氧化钠水 溶液的条件下进4亍的。
该方法用于工业应用的限制是形成不可忽略量的副产物，特别 是难于除去的二酸化合物，需要几次萃取和洗涤处理，或几次再结 晶从而分离产品，且最终目标产品的产量低。
而且，现有4支术没有iJt明用相应二酯化合物的化学选才奪性酶水 解反应制备包括在芳香环上的酯官能团(ester function)的苯乙酸 (phenylacetic acid ) 4匕合4勿的4壬4可方〉去。
特别地，现有^支术没有说明化合物上苯乙酸的酯官能团相对苯 甲酸的酯官能团在包括这两个功能团的化合物上的化学选择性酶 K解方法。
发明内容
发明目的
本发明的主要目的是解决新的技术问题，该技术问题涉及提供 用于制备4-羧曱基-2-乙氧基苯曱酸乙酯，同时避免形成副产物并增 加产量的杀斤方法。本发明的另一个主要目的是解决新的技术问题，该新的技术问
题涉及以最小^:生产成本的方式l是供该壽斤方法。
本发明的另一个主要目的是按照一种新方法来解决上述新问 题，该新方法能够以与药物生产相称的工业量和质量制备所述合成 中间体。
具体实施例方式
发明概要
本申请人现在开发了合成如下定义的分子式(i)的化合物的新 方法。
更具体地，该方法是按照下面示意图A进4亍的
示意图A
(II ) ( I )
其中Rl, R2和R3相同或不同，分别并独立地表示》克基基团。
4安照一个具体实施例，每个基团Rl, R2和R3同时是相同的， 有利地是乙基。
在本发明中，分子式(I)的化合物是通过两个酯官能团中的一 个酯官能团的化学选择性酶水解反应获4寻的。
按照本发明方法的特征是酶水解反应，其包括使分子式(II) 的化合物与酶接触，从而获得分子式(I)的化合物，该酶〗又化学选 择性水解分子式(II)的化合物的两个酯官能团中的一个。在本发
7明中，为了制备瑞格列奈，对中间体的位置4的酯官能团进行化学选择性水解。
按照该方法的另 一个有利的实施例，酶水解反应是在存在有机助溶剂或者没有有机助溶剂的情况下在pH值受控制的溶液中进行的。在反应过程中，控制溶液pH值以〗更酶活性不受该值影响，具体而言，反应过禾呈中，该pH值4呆持在6和8之间。
按照该方法的又一个有利实施例，为了制备合成瑞^"列奈的中间体，酶水解反应是在通过^f吏用緩冲溶液进行控制的受控的pH值下进行的，该緩沖溶液是基于磷酸盐，^碳酸盐或石克酸盐的水溶液，pH值控制在6和8之间。更一般地，緩沖溶液的pH值不影响所用酶的活性。
特别地，緩冲溶液是pH值约等于7.2的水溶液。
按照本发明一个具体实施例，该1￡沖水溶液可通过<吏用基于磷酉交盐，,友酸盐或石克酸盐的7jc溶液来获^寻，其初始pH^f直调节在6和8之间。这样的緩沖水溶液商业上可获得。
按照一个实施例的变型，使用特别基于磷酸钾的初始pH值约为7.2的緩冲水溶液。
*按照本发明另 一个特定实施例，该方法特4正为通过添力。强石咸如石咸金属的氢氧化物或醇盐的水溶液，在方法过程中控制pH值维持在6和8之间。
强碱溶液的浓度(normalit6,当量浓度)要实现pH值的令人满意的调节，使得能够保持酶的活性。按照一个有利的实施例，为了确保保持酶活性并避免在制备瑞才各列奈中具体在位置1的第二酯官能团的显著水解，通过添加强石咸，如石威金属的氢氧〗匕物或醇盐实3见反应介质pH 4直的纟空制。
优选地，pH值的控制是通过添加氢氧化钠卩容液，更具体是氢氧化钠水溶液执行的。碱溶液的浓度要实现pH值的令人满意的调节，使得能够保持酶活性。
4安照本发明该方法的 一个有利实施例，其特4正为酶水解反应是在l(TC到70。C之间的温度，优选在约45。C进4亍。
按照本发明另一个有利实施例，起始物质的初始浓度在1 kg/1和50 g/1之间，并优选在500 g/1和50 g/1之间，且初始浓度非常优选在约400 g/l。
更一般地，起始物质的初始浓度有利地在基本最大值，以便既提供产物在所选溶剂中的溶解性又不削弱酶活性。
在用来实现选择性酶水解的酶中，包括脂肪酶，酯酶，蛋白酶，固定化脂肪酶(chirazymes ),和胰酶。
所用的酶可以是固体形式，在溶液中，在悬浮液中或在惰性载体上固定^f匕。
可以以商业购买的形式直^妾使用酶，或提纯后使用。
示例性的而非限制性的，本发明中可使用的酶是从脂肪酶中选择的，脂肪酶是从曲霉菌(Aspergillus)(黑曲霉(Aspergillus niger )，虫奪蜜曲霉(Aspergillus melleus)， 宇佐美曲霉(Aspergillus usamii))获得的，乂人才艮霉(Rhizopus )(米才艮霉(Rhizopus oryzae )，雪白才艮霉(Rhizopus niveus ),才艮酵菌(Rhizopus sp.)， 爪口圭才艮審(Rhizopus
9javenicus ), Rhizopus delegar， 戴尔才艮霉(Rhizopus delemar ))荻得的，乂人青霉菌(娄地青霉(Penicillium roquefortii),卡门柏青霉(Penicillium camembertii), 圆弧青霉(Penicillium cyclopium ))获得的，从毛霉(冻干的或承载的米黑毛霉(Mucor miehei)(固定化月旨肪酶L9), 爪哇毛霉(Mucor Javanicus )， Mucor Javenicus )获得的，从，i丝酵母(南极々支丝酵母(Candida antarctica), A型冻干的或承载的南极假丝酵母(固定化脂肪酶L5 ), B型冻干的或承载的南极假丝酵母(固定化脂肪酶L2)，圓柱念珠菌(Candidacylindraceae),解脂假丝酵母(Candida lipolytica),铍褶作i丝酵母(Candida mgosa))获得的，^M叚单胞菌(Pseudomonas)(荧光W支单月包菌 (Pseudomonas fluorescens )， 洋葱假单胞菌 (Pseudomonascepacia), 纟录脓片干菌 (Pseudomonas aeruginosa), 施氏作支单月包菌(Pseudomonas stutzed )，布I单月包菌物种)获4寻的，/人产石威谗干菌(Alkaligenes )(产石成杆菌物种)获得的，乂人腐质霉(Humicola )(柔毛腐质霉(Humicola lanuginosa ),柔毛腐质霉脂肪酶(Humicola sp.Lipase ))获4寻的，乂人;也丝菌(Geotrichum )(白i也霉(Geotrichumcandidum))获得的，从胰腺(山羊胰腺，猪胰&泉)获得的，从无色才干菌(Achromobacter )(无色才干菌冲勿种(Achromobacter sp.))获得的，/人嗜热真菌(Thermomyces )(棉毛嗜热真菌(Thermomyceslanuginosus))获得的，和从伯克霍尔德菌(Burkholderia)(洋葱伯克霍尔《急菌(Burkholderia cepacia ))获4寻的。
在其他脂肪酶中，还包括，示例性的而非限制性的，脂肪酶F14，脂肪酶FIO,脂肪酶F12，脂肪酶Al,脂肪酶F7，脂肪酶F13,月旨^r^F8，月旨^r,F2，月旨^r^F3， Amano 6,月旨^^AP15，月旨^r,F, Amano 50,月旨*^ G，月旨^i^F4，月旨Wi^F6,月旨^r^Bl，月旨肪酶PS-D1,脂肪酶PS-C2，脂肪酶1,脂肪酶1 ，脂肪酶2， Euroform脂肪酶4，脂肪酶4，脂肪酶6，脂肪酶7，脂肪酶10,脂肪酶ll,脂肪酶12,脂肪酶13,脂肪酶14,脂肪酶15,脂肪酶18,脂肪酶20，月旨肪酶PGE， Ap-6和丽〉皮月旨肪酶(LipoIase)。
作为非限制性例子中，本发明也可以4吏用从酯酶，猪肝酯酶(PLE)，阿魏酸酯酶，帕罗西汀(paroxetine)酯酶和皱褶々i丝酵母酯酶中选4奪的酶。
作为非限制性例子，本发明也可以使用从下列酶中选^^的酶，即蛋白酶，乂人《连霉菌(灰色《连霉菌(Streptomyces griseus ),嗜热4连王求菌(Streptomyces serine ))、枯草杆菌蛋白酶、(枯草溶菌素(Subtilisin carlsberg ))，冲干状菌(芽孑包4干菌(Bacillus sp.),豆形才干菌 (Bacillus lantus ),月旨肪嗜热芽孑包 一干菌 (Bacillusstearothermophilus ))和番木瓜属(番木瓜(Carica papaya))的混合物中获得的酶。
作为非限制性例子，4安照另一个实施例变型，也可以〗吏用/人固定化脂肪酶，固定化脂肪酶L-8，固定化脂肪酶L-2，固定4匕脂肪酶L-2，固定化脂肪酶L-5，固定化脂肪酶L-10和固定化脂肪酶E1中
选择的酶。
作为非限制性例子，4姿照另一个实施例变型，也可以4吏用乂人另——类酵中选才奪的酵，即Deamizye 50000,月夷酵，Depol ( Depol 222P,Depol454P, Depol 39， Depol 112L， Depol40L， Depol 165L, Depol239P, Depol260P， Depol 333P, D印ol276P, Depol 39P )， Promod(Promod215P， Promod 31L， Promod 192P, Promod 144P, Promod194P ), Combizyme( Combizyme 261P， Combizyme 274P, Combizyme108， Combizyme 23, Combizyme 209 ), Flavopro ( Flavopro 192P，Flavopro 373P， Flavopro 373P(X) ), Macer8 ( Macer8 O, Macer8 R，Macer8 W, Macer8 FJ ),果月交酶(Pectinase )(果月交酶62L,果月交酶444L)， Lipomod 29P ， 肽酶433P (Peptidase 433P)，月旨氧酶(Lipoxygenase ) L583P,纤维素酶(Cellulase ) 13L,氨基酰4匕酶
(Aminoacylase),漆酶(Laccase ) L603P,乳糖酶(Lactase ) L017P，半纤维素酶(Hemicellulase) 344P, TP599P， SP398,复合多泮唐酶
(Viscozyme L )，木聚糖酶(Shearzyme ) 500L， Ultrazyme AFP-L，Peelzyme 1, Ultroflo L， Ultroflo L C809， SP525,才对脂清除酶
(Resinase ) A和Validase TR。
这些酶可/人下列司购买，即Sigma ， Amano , Europa,Biocatalysts， Boehringer， Novo-Nordisk， Biotal, Enzymatix, Fluka，Genecore, Novozymes等。
作为非限制性例子，按照另一个实施例变型，也可在本发明方
法中^f吏用测-汰的商业酶，固定4匕圆柱念J朱菌(Candida cylindracea)(Sigma),固定化B型南才及，I丝酵母(Candida Antarctica B)或
Novozyme 435 (Novozymes), 固定化米黑毛霉(Mucor miehei )(Fluka),固定化洋葱々支单月包菌(Pseudomonas cepacia)或PSD1(Amano ),门多萨邗殳单月包菌(Pseudomonas menodicina )或Lumafast(Genecore )， 疏毛腐质霉(Humicola lanuginose )或丽波月旨肪酶(Lipolase),黑曲霉或AP6 (Amano),卡门柏青霉(Peniciliium
camembertii )或月旨酵G(Lipse G)( Amano ),麦芽(Wheat germ( Fluka ))
或雪白根霉。
优选，所选的酶是脂肪酶，如具体地，乂人B型南4及-底丝酵母获的酶，{列^口/人Novozymes 乂>司购买的Novozyme 43 5 。
按照本发明另一个实施例，所用的酶的量与底物的量的比(表示为重量/重量值)(E/S比)在1/10000和20/100之间，并优选在1/1000和5/100之间。
12」換照本发明又一个实施例，酶浓度可以在0.001 g/1和100 g/1 之间，并^尤选在1 g/1和10 g/1之间。
按照特定实施例变型，酶温育时间在10分钟到4天之间，并 优选在0.5和24小时之间。
按照本发明又一个特定实施例变型，单独或作为混合物可选使 用的有机助溶剂可以是，^旦不限于亚石风，如二甲亚石风(DMSO)，腈， 如乙腈，醇，如乙醇，^又丁醇或异丙醇(IPA)，氨基4匕合物，如二 甲基甲酰胺(DMF),醚，如乙醚，碳氢化合物，如己烷，或芳香 力矣4b合物，^口曱苯。
助溶剂的浓度可以在0.01%到30%之间。
一旦在反应过程中被除去，酶可再次在本发明方法中使用。
更一般地，酶使用的循环次数可在1次到5次之间，优选在1 ;欠到3 ;欠之间。
为了帮助理解，基团、试剂、溶剂或产品的术语是国际术语或 本领域才支术人员通用术语。
术语"烷基，，表示1到IO个碳原子构成的线性或支链烷基链。
术语"烷氧基(alkoxide,醇盐)"表示1到10个碳原子形成 的线性或支链烷氧基基团。术语"碱金属"表示钠或钾原子。
本发明的其他目的，特征和优点可从下面参考本发明几个实施 例的解释性说明中明显看出，这几个实施例仅示例性给出，而非对
本发明范畴^:任何限制。
在实施例中，除非另外指出，百分数都是重量百分数，温度是 摄氏温度，压力是大气压。
为了帮助理解，所用产品的术语是国际术语，且试剂或溶剂的 术语都是本领域^支术人员通用的。
本发明实施例1: 4-羧曱基-2-乙氧基苯曱酸乙酯的制备
分子式(I)的化合物，其中R是乙基。
月旨肪酶Novozyme435。
緩沖溶液0.2M的磷酸钾水溶液，pH值7.2。 酶用量为10mg。
反应是1 ml的量在4 ml玻璃烧瓶中密封进行的。
通过相对所用起始物质的量调整緩沖溶液容积，反应容积被设 定为1 ml。
反应是在45。C进^f亍的。
实施例la): 50 mg 二酯(浓度50 g/1 )。
反应1小时50分钟后，获得100%的转化率。
14实施例1 b ): 100 mg 二酯(浓度100 g/1 )。 反应2小时50分钟后，获得100 %的转化率。 实施Y列1 c ): 200 mg 二酉旨(；农度200 g/1 )。 反应3小时50分钟后，获得80%的转化率。 本发明实施例2: 4-羧曱基-2-乙氧基苯曱酸乙酯的制备 分子式(I)的化合物，其中R是乙基。 月旨肪酶No雨yme435。
纟爰沖溶液0.1 M的石粦酸钾水溶液，pH值7.2。 pH值控制2.5 M NaOH水溶液。
反应在100ml玻璃烧瓶中密封进行的。在10ml磷酸盐緩沖液 中力口入3.86 g ( 13.8 mmol) 二酯，并力口入0.2 g酶。
^质净皮力口戎A至)j 45°C。
通过有^见则地加入氢氧化钠〉容液4巴pH值保持在7.2。
反应1小时35分钟后，获得100%的转化率。
过滤除去介质中的酶。温水洗涤沉积物。收集滤液，并且滤液 用20%的盐酸(HC1)溶'液酸4b，直到pHj直为3.5。
搅动介质然后在冰浴中冷却1小时。形成的沉淀被滤去，然后 在45'C干燥，直到重量恒定。所获得的产物是白色固体。
产量定量的 纯度99.3%。
本发明包括构成上述方法等效手段的所有方法及其不同组合。 根据以上包括实施例的描述，相对现有技术新颖的任何技术特征, 以其功能并作为一^:方法，构成本发明的组成部分。
权利要求
1.根据下面示意图A合成分子式(I)的化合物的方法示意图A其中R1，R2和R3相同或不同，分别独立表示烷基基团，其特征在于，一种酶水解反应包括将分子式(II)的化合物与酶接触，所述酶仅对分子式(II)的化合物的两个酯官能团中的一个进行化学选择性水解，以便获得所述分子式(I)的化合物。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述水解反应是在 有或没有有才几助溶剂的情况下，在pH值受控制具体地通过利 用緩沖溶液控制的溶液中进行的。
3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所使用的酶选 自月旨肪酶、酯酶、蛋白酶、固定化脂肪酶和月夷酶。
4. 根据权利要求l、 2和3中任一项所述的方法，其特征在于， 所-使用的酶是脂肪酶。
5. 根据权利要求1到4中任一项所述的方法，其特征在于，所使 用的酶以固体形式、或以溶液、或以悬浮液、或以固定在惰性 载体上的形式存在。
6. 根据权利要求1到5中任一项所述的方法，其特征在于，所选 的酶可以商业购买的形式直接使用或在^是纯后使用。
7. 根据前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，在反应过 程中控制所述pH值，以便所述酶的活性不受该pH值影响， 具体地，该pH值在反应过程中被保持在6到8之间。
8. 々艮据前述任一项权利要求所述的方法，其特4正在于，所选酶的 循环使用的次数在1到5之间。
9. 才艮据前述4壬一项4又利要求所述的方法，其特;f正在于，所4吏用的 酶的量与底物的量的比(E/S比)以重量/重量Y直表示在1/10000 到20/100之间，并优选在1/1000到5/100之间。
10. 才艮据前述4壬一项一又利要求所述的方法，其特4正在于，所述起始 4勿质的详刀4台^农度在1 kg/1到50 g/1之间。
11. 才艮据前述任一项一又利要求所述的方法，其特;f正在于，所述酶水 解是在10。C到70。C之间的温度进4亍的。
12. 根据前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述反应 介质的pH值的控制是通过添加强碱，特别是碱金属氢氧化物 或醇盐实if见的。
13. 才艮据前述任一项片又利要求所述的方法，其特4正在于，没有有枳j 助》容剂。
14. 根据前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，每个基团 Rl、 R2和R3同时是乙基。
15. 根据权利要求1到14中任一项所述的方法，其特征在于，所 使用的酶是从B型南极假丝酵母获4寻的脂肪酶。
16. 根据权利要求1到15中任一项所述的方法，其特征在于，緩 冲〉容液是pH值在6到8之间的基于磷酸盐、碳酸盐或石克酸盐 的水溶液，特别是基于》粦酸钾的水:容液。
17. 才艮才居一又利要求14、 15和16中任一项所述的方法，其净争4i在于， 所述纟爰沖溶液的初始pH值为约7.2。
18. 根据权利要求14到17中任一项所述的方法，其特征在于，所 述反应温度优选为约45°C。
19. 根据权利要求14到18中任一项所述的方法，其特征在于，所 述分子式(II)的起始物质的初始浓度为约400g/l。
20. 根据权利要求14到19中任一项所述的方法，其特征在于，所 述pH是通过添加强石威水溶液，特别是氢氧4匕钠水溶液来控制 的。
21. 根据权利要求14到20中任一项所述的方法，其特征在于，酶 的量在1 g/l到10g/l之间。
22. 根据权利要求14到21中任一项所述的方法，其特征在于，所 述分子式(I)的化合物用作用于制备瑞格列奈的合成中间体。
全文摘要
本发明涉及一种合成方法。该方法涉及按照右面示意图A合成分子式(I)的化合物，其中R1，R2和R3可以相同或不同，分别独立表示烷基基团，其特征是一种酶水解反应，包括将分子式(II)的化合物与酶接触，该酶仅化学选择性水解分子式(II)的化合物的两个酯官能团中的一个，以便获得分子式(I)的化合物。本发明允许工业制备分子式(I)的中间体，该中间体可用于制备药物活性成分瑞格列奈。
文档编号C12P7/62GK101652483SQ200880002850
公开日2010年2月17日 申请日期2008年1月22日 优先权日2007年1月22日
发明者米歇尔·洛兰格拉克莱, 让-克洛德·卡耶, 阿兰·比尔戈斯 申请人:Zach系统股份公司;诺瓦克塔生物系统有限公司