专利名称：：一组基于三疣梭子蟹its基因的微卫星引物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一组基于三疣梭子蟹ITS基因的微卫星引物，可应用于三疣梭子蟹的种质鉴定与评价和遗传结构分析的微卫星引物。
背景技术：
：三疣梭子蟹(/3的^^/TM/a似力，俗称海蟹或大蟹，属于甲壳纲，十足目，梭子蟹科。它广泛分布在中国南北沿海，是中国大型海洋经济蟹类，是沿海重要的渔业资源，开展三疣梭子蟹群体遗传结构分析和种质鉴定工作，对于三疣梭子蟹的增养殖亲本选择和原种、家系和优良品种资源保护具有重要的应用价值。目前常用来进行评价生物遗传多样性和种质鉴定的分子标记均具有一定程度的缺陷，如RAPD技术(随机扩增序列多态性DNA,RandomamplifiedpolymorphicDNA),常因RAPD引物过短10个碱基、退火温度过低一般36-37°C，导致扩增产物的一些非特异结果，其可靠程度和真实性是主要的缺陷；而AFLP技术(扩增片段长度多态性，Amplifiedfragmentlengthpolymorphism),又因操作条件复杂如要求酶切、成本相对较高而限制了其广泛的应用。微卫星标记是一种新兴的分子标记技术，实质就是基因组中大量存在的串联重复序列，以这些重复序列作为遗传标记可以进行种质鉴定与标记、遗传多样性分析、遗传连锁图谱的构建等一系列工作，其工作原理是通过已知的基因序列寻找微卫星序列然后在微卫星序列上下游设计特异性引物，这样设计的引物就成为微卫星引物，通过使用设计好的成对引物就可以通过PCR技术扩增出微卫星标记带，通过电泳凝胶成像技术成像后进行种质鉴定与标记、遗传多样性分析或遗传连锁图谱的构建。应用微卫星引物扩增出的微卫星序列电泳分离时具有单碱基的高分辨率，遗传信息量大，通常为显性标记，呈孟德尔式遗传，具有很高的稳定性和多态性，且DNA用量较AFLP少，技术要求低，微卫星标记技术则正好克服了RAPD和AFLP技术的这些缺点，具有很好的应用价值。'ITS(IntemalTranscribedSpacer),为核糖体转录间隔区域，编码核糖体的18srRNA、5.8srRNA和28srRNA基因的两段内转录间隔区，ITS-1和ITS-2具有较快的进化速率。目前，ITS作为分子标记在种质资源评价和群体结构分析中被认为是最广泛的基因之一。
发明内容本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一组基于三疣梭子蟹ITS基因的微卫星引物，该引物可克服现有技术引物过短，退火温度低，操作条件复杂，成本高、准确性低的缺陷。本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一组基于三疣梭子蟹ITS基因的微卫星引物，其特点是，它通过以下步骤如下，(1)^^集三疣梭子蟹活体运回实验室提取基因组DNA，通过PCR扩增三疣梭子蟹的ITS基因，将该基因电泳回ITS目的片段，将该片段与载体进行连接反应后转化大肠杆菌DH5a感受态细胞中，进行克隆后双向测序；(2)将测定序列通过正反向拼接后建立完整的ITS基因序列，通过TRF程序来査找微卫星位点；(3)X寸找到的可用位点应用GenamicsExpressionTrialVersion1.1程序来设计微卫星引物，最终得到如表1所示微卫星引物(SEQUENCENO:1-16)及对应的引物指标参数。以下对发明人所作的研究试验进行阐述。实验用三疣梭子蟹采集于辽宁大连、山东东营、江苏连云港、浙江舟山、福建纟章州、广东湛江6个种群地区海域，采集时间、地点、简称及采集数量见表2，采集到的三疣梭子蟹活体运回实验室，-7(TC低温冰箱或75%酒精保存。(1)DNA提取取组织约50mg，先用蒸馏水将组织中的乙醇清洗干净，然后按照常规的酚一氯仿法提取DNA。(2)PCR扩增及其产物的纯化、克隆ITS区的引物序列为ITSF:5'-TACGTCCCTGCCCTTTGTA-3邻ITSR:5'-TGTTGGTTTCTTTTCCTCCG-3'(由上海生工生物工程技术服务有限公司5合成)。其中ITSF序列为18SrRNA序列，反向引物ITSR为28SrRNA序歹ij，这样获得的产物为含有部分18SrRNA序列和部分28SrRNA序列，中间部分则为全部的ITS全长序列，中间包含一个5.8S的序列，本研究中所指ITS基因包含有三段分别为ITS1，5.8SrRNA和ITS2，均为全长序列。PCR反应总体积为50(il，包括5^110XPCRBuffer,,125mmol/LMgCl2，1(il10mmol/LdNTP4|al2.5mmol/L双向引物，0.4jilTaqDNA聚合酶(5U/(il),3plDNA模板，加无菌双蒸水至50fi1。PCR反应条件为94'C预变性5min后进行降落PCR，94。C变性45s，53。C退火45s(每5个循环降低2°C)，72。C延伸1.5min，15个循环，接下来进行94。C变性45s,47。C退火45s,72。C延伸1.5min,15个循环，最后72。C充分延伸10min4。C保存。PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳，染色后在凝胶成像系统检测。用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒(上海生工生物技术有限公司)纯化回收目的带后，与PUCm-T载体进行连接反应，16t;水浴2h，转化大肠杆菌DH5a感受态细胞中，与含Amp的LB平板过夜，挑取白色单菌落，以菌斑为模板，迸行PCR扩增，电泳检测并筛选阳性转化子。表1三疣梭子蟹ITS基因微卫星引物及对应的引物指标参数表引物编号重复类型可能的重复数微卫星起始位置上下游引物序列引物起始位置T迈值('C)扩增目的片段大小F:GAACCTGCGGAAGGATCATTATCGT2260ITS157AATC0-4.381157bpR:TTGTACTCCTGCGGACGGTGGCACA15468F:ATAATGGCCGTGTGCCAC10851ITS91ACA0-3.314091bpR:GTCAAACAGGGAAGGAGGC18051CTCCF:GCCTCCCTTGCCTGTCAACA15557ITS1060-2215106bpAR:GGTCTACCGCTCAAACAATCCTT23855F:ATACTTTCCTTCGTGCAAGGA22551ITS211CTA5.3-7.3270211bpR:ACACGGGTAGTGTACGGTTTAA41451F:CGATGGAGCGTAGAAGTGAGT32651ITS229TAC4-5443229bpR:TGGAATTACGTCGGAACTAGG53451F:AGGCAGAGGCAGTGGAAGTCTG50057ITS395TAC3.3-4.3771395bpR:GGGACCGCTTCCGTTAGGATTT87359F:TAGTACAATGAAATGAGGGCACC83453ITS291CTAG2.5-6.51066291bpR:AATCATAGGAGGTTGGGAGCC110454F:ACGTTGAGTGGAGCCAAAA124847ITS232GA5-61311232bpR:GGTTTCTTTTCCTCCGCTTAl柳45表2三:疣梭子蟹样本信息采集地点大连(L)连云港(G)东营(DY)舟山(Z)漳州(zz)湛江(C)釆样曰期2005.92005.102005-112005-92006.12005-采集个体数目223133301036曱壳宽度(cm)平均值i标准差13.40±0.5515.75±1.5914.37±1.0411.94±1.4516.20±1.6616.85±1.75(3)测序将克隆产物送上海华大天源生物科技务有限公司进行纯化回收，然后采用扩增产物在ABIprismTM377测序仪上直接进行正反双向测序，6个群体共测定出24个三疣梭子蟹ITS基因序列——初始序列(5'-部分18SrRNA序列-ITS基因序列-部分28SrRNA序列-3，序列表中的第41、42号序列(SEQUENCENO:41-42)为其中的2个原始序列)，其中去掉载体后的序列的结构为5'-部分18SrRNA序列-ITS基因序列-部分28SrRNA序列-3,中间部分则为全部的ITS全长序列(序列表中第16-40号共24个序例，SEQUENCENO:16-40)。以上序列的确定均通过GenBankBlast同源比对而确定。(4)微卫星位点的确定将测序的结果使用DNASTAR软件中的Seqman程序进行双向拼结，ITS基因的序列见序列表，并将所有序列使用DNASTAR软件中的Seqman程序转化为基因序列的FASTA格式，以便TandemRepeatsFinder软件识别(简称为TRF程序)。将序列转化成FASTA模式后用TRF程序依次打开，设定TRF程序的math(匹配),mismath(错配)和indel(插入缺失)参数为分别为2，7，7,最小重复序歹i!(minimumalignmentscoretoreportreapeat)为20，最大区间(maximumperiodsize)为2000，然后运行Run,结果即保存到FASTA文件格式的目录下，即序列数据所在的文件夹中，每Run—个FASTA格式的序列文件变会产生两个HTML格式的结果文件。HTML格式的结果文件中分别显示微卫星所在的序列位置，大小，拷贝数，重复碱基等情况。将所有的FASTA格式序列文件通过运行TRF程序查找到的微卫星结果;每一个个体对应两个结果文件，一个以表格形式概括找到的微卫星所以位置(Indices)、重复大小(PeriodSiz)和重复数(CopyNumber),另一个是表格内容的对应序列的列举。将所有三疣梭子蟹个体的微卫星结果中这三个指标汇总结果到表3。表3即为三疣梭子蟹ITS基因中所存在的所有微卫星标记。7表3三疣梭子蟹ITS基因中的微卫星分布<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>AATC重复次数为3.3次.在上述表3中，个体一纵栏三疣梭子蟹的个体编号(从L5到ZZ7共24个个体)所对应的序列自上而下依次对应序列表中的第17-40号序列(SEQUENCENO:17至SEQUENCENO:40)。上述DNASTARV3.0软件的出处为SteveShearDown,1989-2001versionreservedbyDNASTARInc.,Madison,WI，USA;上述TandemRepeatsFinde(TRF)软件的出处为G.Benson,"Tandemrepeatsfinder:aprogramtoanalyzeDNAseq職ces"NucleicAcidsResearch(1999)Vol.27,No.2，pp.573-580.网址为http:〃tandem.buedu/trf/trf.html(5)微卫星引物的开发考虑到开发微卫星分子标记能够应用这就要求具有良好的多态性，故将表3中不存在多态性的微卫星位点去掉，因此"GAGGCA"、"GCG"、"ATATC"和"GCGTGT"这四个微卫星将不作考虑，因为"GAGGCA"均为重复2.2次，"GCG"均为重复3.7次，"ATATC"均为重复2.2次，"GCGTGT"均为重复2次，其余的微卫星均有多态产生，开发的微卫星标记引物组是理想的。用表3中所有具有多态性的微卫星来开发引物，以AATC为例，其余过程相同。开发过程如下对表3中重复类型为AATC的微卫星，将其任一个体的序列导入到引物设计软件(选择设计引物的个体ITS基因序列依据为不同个体的微卫星两侧翼区序列均保守相同，因此任一个体均可以用来设计引物，出于方便，一般选择该微卫星位点没有丢失的序列来设计，如AATC这个微卫星则最好选择Lll(SEQUENCENO:19)，DY3(SEQUENCENO:22)等等含有AATC3.3个拷贝的三疣梭子蟹个体ITS基因序列。下面以Lll(对应SEQUENCENO:19)为例说明AATC微卫星引物开发过程打开软件GenamicsExpressionTrialVersion1.1程序(出自http:〃genamics.com/expression/),(因原始序列中的ITS基因的起始序列含有一段18SrRNA基因，而ITS全长序列中AATC微卫星所在位置位于靠近ITS区的起始81bp处，碱基过短不利于引物的选择，因此，选择在18SrRNA基因上设计上游引物，同理，表3中的最后一个微卫星GA则在ITS末端区，下游引物则要在部分28SrRNA序列上设计引物)，将序列表中的第41号序列(SEQUENCENO:41)全部序列复制到已打开的GenamicsExpression程序中的"DNA1"文件输入区域，点击菜单栏中的"Sequence"—"Circulartolinear"即可把环状DNA变成线型DNA;下一步，点击工具栏中PrimDsnr按钮，则出现了所有备选的引物组合，选择的依据是上下游引物通火温度相近即可，引物间包含有AATC微卫星，同时两引物间不含有别的微卫星，因此对AATC微卫星可供设计引物的区域为序列表中的第41号序列的0-172间，符合该要求的引物为F:GAACCTGCGGAAGGATCATTATCGT，Tm为60，起始位置为22，引物长25bp;R:TTGTACTCCTGCGGACGGTGGCACA,Tm为68，起始位置为154，引物长为25bp，这样扩增的目的片段为158bp,这样同样的将表3中其余的7个可用的微卫星的引物设计出来，其余微卫星设计引物的序列除GA用序列表中的第42号序列(SEQUENCENO:42)，CTCCA用序列表中的第30号序列(SEQUENCENO:30)夕卜，其余5个均使用序列表中的第18号序列(SEQUENCENO:18)来设计。结果得到如表1所述的基于三疣梭子蟹ITS基因微卫星引物。本发明将微卫星和ITS的优点结合起来开发得到基于三疣梭子蟹ITS基因的微卫星标记引物，且开发出该基因的微卫星标记引物具有重要的应用价值。本发明筛选出的引物扩增产物清晰、稳定、多态性好，可应用于三疣梭子蟹的种质评价和种质鉴定以及三疣梭子蟹的群体遗体多样性评价，具有快速、经济、准确和操作简便等特点，可克服现有技术引物过短，退火温度低，操作条件复杂，成本高、准确性低的缺陷。具体实施例方式以下进一步描述本发明的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进一步地理解本发明，而不构成对其权利的限制。实施例l。本发明是一组基于三疣梭子蟹ITS基因的微卫星引物，它通过以下步骤得到，(1)采集三疣梭子蟹活体运回实验室提取基因组DNA，通过PCR扩增三疣梭子蟹的ITS基因，将该基因电泳回ITS目的片段，将该片段与载体进行连接反应后转化大肠杆菌DH5ct感受态细胞中，进行克隆后双向测序；(2)将测定序列通过正反向拼接后建立完整的ITS基因序列，通过TRF程10序来査找微卫星位点；(3)对找到的可用位点应用GenamicsExpressionTrialVersionU程序来设计微卫星引物，最终得到如表1所示微卫星引物及对应的引物指标参数。实施例2。用实施例1所述基于三疣梭子蟹ITS基因的微卫星引物进行群体遗传结构分析，其步骤如下，1.引物的合成应用DNA合成仪合成表1中的引物8对，各20D，一般由有DNA合成能力的生物工程公司来完成。2.三疣梭子蟹基因组的提取采集三疣梭子蟹几个家系样本各30个，新鲜样品带回实验室，采用标准酚-氯仿法抽提基因组DNA。具体过程及试剂配方，三疣梭子蟹的基因组DNA采用SDS裂解液配方10mmol/LTris.Cl(pH=8.0)，O.lmmol/LEDTA(pH=8.0)，0.5%SDS，提取的步骤为取三疣梭子蟹的肌肉组织50mg，放入液氮中研磨成细粉，放入2.0ml的离心管中，加入600(il的SDS组织裂解液，放入55。C水浴摇床，裂解lh后加入蛋白酶K10pl(20mg/ml)，继续裂解34h，然后将离心管取出用手指轻弹离心管底部,让未裂解组织与裂解液充分接触，使组织细胞能够充分裂解，裂解完毕后每只离心管加入600^dTris饱和酚，轻轻振荡摇匀，颠倒45-55次，室温静置1015min，12000rpm，4。C离心10min，取上清液，加入60(V1氯仿异戊醇混合液，轻轻振荡摇匀，颠倒45-55次，室温静置1015min，12000rpm，离心10min，取上清液，加入120(^1冷冻无水乙醇，颠倒45-55次，室温静置1015min，8000rpm，离心10min，弃上清，即得DNA，在离心管中加入1500(^170%的乙醇，洗涤两次，然后8000rpm，离心8min，弃上清，室温风干，直至乙醇挥发完毕，加入50ili1TE，溶解DNA，4。C保存，制备0.8%琼脂糖凝胶电泳检测。3.PCR反应体系PCR体系:25[il，Mg"浓度为2.5腿ol/L、lOXBuffer的体积为2.75)nl、DNA模板50ng、Taq酶1U、dNTPmixture0.5jul，引物2]ul，其余用水补足；反应条件首先95。C预变性5min，然后进入以下40个循环94。C变性45s，45°C-52°C(不同引物对应不同的退火温度见表1)Touchdown程序退火45s，ii72。C延伸1.5min，然后72。C再次延伸10min，最后4。C保存。4.电泳检测与数据统计(1)8%变性聚丙烯酰胺的制备:15ml8%变性胶，7.5ulTEMED,10ulAP。(2)上样变性上样缓冲液配方为98%甲酰胺49ml，lOmMEDTA(pH8.0)1ml，0.25%溴芬兰125g，0.25%二甲苯青0.125g，加水到50ml。以PCR产物和上样缓冲液体1:l加样2-4微升，同时设立合适的DNA分子量标准物(DL-2000);(3)电泳电压以400V左右维持2h置，待溴酚蓝指示剂移至距凝胶前沿l-2cm处时，关闭电源；(4)取出凝胶板，用硝酸银染色；(5)凝胶呈像系统(ChemiDocXRS)拍照，记录结果；(6)经电泳获得的图谱每群体在所有位点的谱带式样组成一个01矩阵。用Arequin2.0软件进行分子方差分析(AM0VA)，计算遗传多态度(ti)和遗传分化指数(Fst)等各种种质资源评价指标，最终得出评价结果。实施例3。用实施例1所述基于三疣梭子蟹ITS基因的微卫星引物进行家系鉴定，其歩骤如下，1.提取三疣梭子蟹繁育家系的基因组DNA(1)SDS裂解液配方10mmol/LTris.CI(pH=8.0)，0.l謹ol/LEDTA(pH:8.0)，0.5%SDS。(2)步骤取三疣梭子蟹的步足上的肌肉组织50mg，放入液氮中研磨成细粉，放入2.0ml的离心管中，加入600ji1的SDS组织裂解液，放入55'C水浴摇床，裂解1小时后加入蛋白酶K1(^1(20mg/ml)，继续裂解34个小时，然后将离心管取出用手指轻弹离心管底部,让未裂解组织与裂解液充分接触，使组织细胞能够充分裂解；裂解完毕后每只离心管加入600^1Tris饱和酚，轻轻振荡摇匀，颠倒45-55次，室温静置1015min;12000rpm，4离心10min;取上清液，加入600|il氯仿异戊醇混合液，轻轻振荡摇匀，颠倒50次；室温静置1015min;12000rpm，离心10min;取上清液，加入1200^1冷冻无水乙醇，颠倒45-55次；室温静置1015im'n;12000rpm，离心10min;弃上清，即得DNA，在离心管中加入1500^170%的酒精，洗涤两次，然后8000rpm，离心8min;弃上清，室温风干，直至乙醇挥发完毕；加入5(V1TE，溶解DNA，4。C保存；制备0.8%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。2.合成10条三疣梭子蟹引物利用实施例1合成表1中的10条引物。3.PCR反应体系PCR体系:25^1，Mg"浓度为2.5mmol/L、10XBuffer的体积为2.75(^1、DNA模板50ng、Taq酶1U、dNTPmixture0.5jlU，引物2pl，其余用水补足；反应条件首先95。C预变性5min，然后进入以下40个循环94。C变性45s，45°C-52°C(不同引物对应不同的退火温度见表1)Touchdown程序退火45s，72。C延伸1.5min，然后72。C再次延伸10rain，最后4。C保存。4.电泳检测与数据统计(1)8%变性聚丙烯酰胺的制备:15ml8%变性胶，7.5ulTEMED，編AP。(2)上样变性上样缓冲液配方为98%甲酰胺49ml，10mMEDTA(pH8.0)1ml，0.25%溴芬兰0.125g，0.25%二甲苯青0.125g，加水到50ml。以PCR产物和上样缓冲液体1:l加样2-4微升，同时设立合适的DNA分子量标准物(DL-2000);(3)电泳电压以400V左右维持2h置，待溴酚蓝指示剂移至距凝胶前沿l-2cm处时，关闭电源；(4)取出凝胶板，用硝酸银染色；(5)凝胶呈像系统(ChemiDocXRS)拍照，记录结果；(6)经电泳获得的图谱找到所要研究家系的相应特异性分子标记，作为该家系的分子标记。SEQUENCELISTING<110>淮海工学院<120>—组基于三疣梭子蟹ITS基因的微卫星引物<130>200卯1<160>42<170>Patentlnversion3.3<210>1<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>1gaacctgcggaaggatcattatcgt25<210>2<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>2ttgtactcctgcggacggtggcaca25<210>3<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>3ataatggccgtgtgccac18<210>4<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>4gtcaaacagggaaggaggc19<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>5gcctcccttgcctgtcaaca20<210>6<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>6ggtctaccgctcaaacaatcctt23<210>7<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>7atactttccttcgtgcaagga21<210>8<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>8acacgggtagtgtacggtttaa22<210>9<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>9cgatggagcgtagaagtgagt21<210>10<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>10tggaattacgtcggaactagg21<210>11<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>1115aggcagaggcagtggaagtctg22<210>12<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>12gggaccgcttccgttaggattt22<210>13<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>13tagtacaatgaaatgagggcacc23<210>14<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>14aatcataggaggttgggagcc21<210>15<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>15acgttgagtggagccaaaa19<210>16<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>16ggtttcttttcctccgctta20<210>17<211>1363<212>DNA<213>三疣梭子蟹(P.trituberculatus)16aaggatcattatcgtgacgtttctgaaaggaacgeaactaaaagttaaaaagctcgcacc60agggtggcggggtctggcctaatcaatcagtcagcagctcctgcggggsigaacggccgtg120tgccaccgtccgcaggagtacaacaagtagtaggggcctcccttgcctgtcaacagggcc180tccttccctgtttgacaaccttttctccsctcatsctttccttcgtgcaa240ggatcgtttgagcggtagacC33C3CCt3Cetaegtatgetgaacttact300accttattscccctgggataccatggcgatggggCgtagaagtgagtgactgcggcagca360ctgactgctsigctgctcacatgctgcgttcggtcgtccccagtgggtatcattaaaccgt420acactacccgtgtactcaatctscccsttttcactacgtc480ttcccacaagtctcctgaggcagaggcagtggaagtctgataaagagtcggcctagttcc540gacgtaattcttaacggtggatcactcggctcgtgggtcg600atgaagaccgcagcaagctgcgtgtcggtatgtgaatcgcaagaataccagatacatcga660caagtcgaacgcacattgcggcggcggcactctcatgtgctgccgtcactcctacacgag720ggtcggatatgeateggcattgtccagccgcgcaagttactactactact780ctttcs站ccacattcgcgccgaaagggcttcacsccctcacgcgcgtttgtagtacaat840gaaatgagggC3CCCtt3t3aagegggaceggaagcggtcccgtgggtga900gatgcatcatggcatctttcagagtgcttgcgttggtctggctttgacc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