专利名称：低温碱性蛋白酶基因、含有该基因的工程菌及二者的构建方法以及低温碱性蛋白酶的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程领域,涉及基因的突变和重组技术，尤其是低温碱性蛋白酶基因、 含有该基因的工程菌及二者的构建方法以及低温碱性蛋白酶。
背景技术：
碱性蛋白酶(EC3.4.21.62)是一种在碱性范围内水解蛋白质肽键的酶类，其最适pH 一般为9.0-11.0，属内肽酶中的丝氨酸蛋白水解酶类，被广泛应用于洗涤剂、食品、化妆 品、水产饲料、制革、纺织以及医药等领域。
碱性蛋白酶在碱性条件下具有较好的催化蛋白质肽键水解的能力，其碱性pH与通常洗 涤衣物的环境的pH9.0-12.0相似，因此，碱性蛋白酶己经作为添加剂广泛应用于洗涤剂行 业。添加碱性蛋白酶后的洗涤剂具有更好的去污效果，能够大大縮短洗涤时间，提高洗涤 效率，可防止蛋白质污渍再次沉积在织物上，起到增白作用。Rohm于1913年最早提出将 碱性蛋白酶添加入洗涤剂中，在20世纪60年代，市场上出现了第一种添加了来源于^^7/w //dew/w7m;y蛋白酶的洗涤剂。目前，碱性蛋白酶的销售额约占世界酶制剂市场的25%，在 欧洲加酶洗衣粉的比例则达到80%左右。
碱性蛋白酶广泛存在于细菌、放线菌和真菌中，其中以芽孢杆菌属的碱性蛋白酶研究 的最深入，几乎所有的商业化碱性蛋白酶均来源于芽孢杆菌属。芽孢杆菌碱性蛋白酶的最 适作用温度为60 'C，欧洲人洗衣通常先用40-6(TC热水浸泡，其中的碱性蛋白酶可充分发 挥作用，而40-6(TC的洗涤温度需要给水加热，会产生较大的能源浪费，在亚洲特别是发 展中国家习惯用自来水洗衣，而碱性蛋白酶在较低的温度下又无法发挥最大的酶活力，使 洗涤剂不能充分发挥其洗衣效力，因此有必要开发一种最适温度为低温的碱性蛋白酶。
利用诱变剂对产酶菌株进行诱变处理等传统的工业微生物育种方法，简单可行，但工 作量大，且很难筛选到符合工业生产要求的理想菌株。对酶蛋白从分子水平进行定向改造 是近年来发展起来的一种新方法，酶的定向进化是从一个或多个已经存在的亲本酶出发， 利用error-prone PCR、 DNA shuffling等技术，经过基因的突变和重组，构建一个突变酶 文库，通过筛选最终获得具有某些特性的酶基因。国内外已有很多利用定向进化技术对酶 进行改造的相关报道。酶的定向进化不需准确的酶分子的结构信息，而是通过随机突变、 基因重组、定向筛选等方法对其进行改造，具有较强的实用性。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种利用error-prone PCR、 DNAshuffling方法对嗜碱芽孢杆菌成熟肽基因进行定向改造获得的一种低温碱性蛋白酶基因、
采用该基因构建和筛选得到了一种产低温碱性蛋白酶的工程菌以及含有该基因的低温碱
性蛋白酶。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的
一种低温碱性蛋白酶基因，其基因序列描述如SEQ ID No.2，序列特征为810bp， 核酸，单链，线性，DNA。
而且，所述基因的源基因是从嗜碱芽孢杆菌(^"7/wa/ca/oi^^ ATCC 21522)中
获得的。
一种低温碱性蛋白酶基因的构建方法，构建的歩骤是
a)碱性蛋白酶成熟肽基因的获得；
(2) 碱性蛋白酶成熟肽基因的定向改造，以获得具有不同特性的碱性蛋白酶的基因文
库；
(3) 表达载体构建以及含有低温碱性蛋白酶基因的工程菌的构建以及筛选；
(4) 筛选得到目的菌株后进行测序，得到该基因序列。
一种含有低温碱性蛋白酶基因的工程菌，该工程菌具有产低温碱性蛋白酶的特性。 一种产低温碱性蛋白酶工程菌的构建方法，步骤包括
(1) 碱性蛋白酶成熟肽基因的获得；
(2) 碱性蛋白酶成熟肽基因的定向改造，以获得具有不同特性的碱性蛋白酶基因文库；
(3) 表达载体构建以及含有低温碱性蛋白酶基因的工程菌的构建以及筛选。
而且，所述歩骤(2)中碱性蛋白酶成熟肽基因的定向改造方法采用error-prone PCR和 DNA shuffling 。
而且，所述步骤(3)中表达载体为pBE2R， pBE2R是一种大肠-枯草穿梭分泌表达型载 体，含有一个强启动子P43启动蛋白酶基因的转录， 一个嗜碱芽孢杆菌碱性蛋白酶信号 肽用于指导菌体中合成的蛋白酶分泌至胞外。
而且，所述步骤(3)中构建工程菌的宿主菌为枯草芽孢杆菌Sad//^ w^"fc WB600， 该菌为6种胞外蛋白酶缺失菌株。
一种产低温碱性蛋白酶工程菌发酵生产的低温碱性蛋白酶，该酶的成熟肽碱基序列为 SEQIDNo.2,最适作用温度为3(TC，最适作用pH为ll.O。
本发明的优点和积极效果是
1、本发明涉及的工程菌所产碱性蛋白酶在25-35t:均具有较高活性，其最适温度为 30°C，最适pH为ll.O，由此可知该酶在较低温度的碱性条件下均具有较高活性，解决了现有技术中较高作用温度引起的能源浪费的问题，使用该酶开发的洗漆剂更加适合亚洲特 别是发展中国家的洗衣习惯，节约能源的同时减少温室气体排放量。
2、本发明利用error-prone PCR、 DNAshuffling对嗜碱芽孢杆菌成熟肽基因进行改造， 与质粒pBE2R连接，先转化五.co// DH5a ,阳性转化子经提取质粒转化Sa"7/附w6rtto WB600构建基因突变文库，从中筛选出一株产低温碱性蛋白酶的基因工程菌；该菌株通 过发酵、分离得到的低温碱性蛋白酶，为洗涤剂中添加使用的低温碱性蛋白酶提供了理论 基础，具有重要的经济效益和社会效益。
图l为本发明碱性蛋白酶成熟肽基因"p，N)的PCR电泳图2为本发明error-prone PCR扩增的碱性蛋白酶成熟肽基因(qprN)的电泳图3为本发明重组表达载体pBE2R-a/^N的构建及定向进化示意图4为本发明碱性蛋白酶成熟肽基因fl^N的DNA shuffling过程示意图5为本发明碱性蛋白酶最适作用pH;
图6为本发明野生型碱性蛋白酶、突变后碱性蛋白酶最适作用温度示意图，其中□
为野生型，A为突变型。
具体实施例方式
下面结合实施例，对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不 能以下述实施例来限定本发明的保护范围。 实施例
1、碱性蛋白酶成熟肽基因aprN的获得
(1) 嗜碱芽孢杆菌(&a7/Ma/m/o/ Mw5ATCC 21522)的培养及染色体DNA的提取 挑取嗜碱芽孢杆菌单菌落接入LB液体试管中，培养温度为37'C,摇床转速为180r/min，培 养时间为12h，用生工生物工程(上海)有限公司UNIQ-10柱式细菌基因组DNA抽提试剂 盒提取嗜碱芽孢杆菌的染色体基因组。
(2) 碱性蛋白酶成熟肽基因的获得参照NCBI上报道的碱性蛋白酶成熟肽基因(a，N) 序列如SequenceNo.l，(序列号M65086)设计引物
上游引物P1: 5，-TCAGTGCCATGGGGAATTAGCCGTGTG -3，(下划线部分引入7Vco I 酶切位点)
下游引物P2: 5，-AAAAGGATCCTTAGCGTGTTGCCGCTTCTGCATTG-3，(下划线部分 引入SflwHI酶切位点)
以嗜碱芽孢杆菌染色体DNA(10ng)为模板，PCR反应体系为ddH2O20(^l， 10xbuffer 2.5^1, dNTPlpl，上下游引物(lOpmol/pl)各0.5pl，模板10ng， Ta《酶0.25U。扩增条件 为94。C预变性lmin; 94。C变性30s， 55。C退火30s， 72。C延伸lmin，反应30个循环；72°C 延伸5min。 PCR产物(印rN)经琼脂糖凝胶电泳检测，在约810bp处出现特异性条带，结 果如附图l所示，其大小与NCBI上报道的吻合。
52、采用error-prone PCR、 DNA shuffling对a; rN的定向改造
(1) error-prone PCR对a;7rN的随机突变
将PCR扩增得到的产物经琼脂糖凝胶回收，适当稀释作为error-pronePCR的模板。采 用50^1的反应体系ddH204pl， 10xbuffer 5^x1， MgCl2 (25mM) 14pl， MnCl2 (10mM) 3pl' dATP(10mM)lpl， dGTP(10mM)1 pl， dCTP(10mM)5pl， dTTP(10mM)5nl，上游引物
(10pmol尔l) 0.5pl，下游引物(10pmolVl) 0.5W， DNA模板10ng， ra《酶0.5U。 PCR扩增 条件94。C预变性lmin; 94。C变性30s， 5(TC退火30s， 72。C延伸lmin，反应30个循环；72°C 延伸5min。 PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，在约810bp处出现特异性条带，结果如附图2 所示。将error-prone PCR产物和大肠-枯草穿梭质粒pBE2R分别用jVcoI和&mffl双酶切，酶 切产物用DNA片段纯化试剂盒Ver.2.0 (TaKaRa)纯化回收，采用DNA连接试剂盒Ver.2.0
(TaKaRa) 16。C连接6h，形成连接质粒pBE2R-aj^N。
(2) 五.co/ZDH5a的转化
从Aa^'DH5a平板上挑取一个单菌落接于2ml LB液体培养基的试管中，37'C振荡培养 过夜。取0.5ml菌液转接到装有50mlLB液体培养基三角瓶中，37。C振荡培养至OD6加约0.5， 将菌液转移到50ml离心管中，冰浴10min。 4000r/min离心10min，回收细胞。倒出培养液， 用冰冷的0.1mol/LCaCl2l0ml悬浮细胞，冰浴30min。 4°C、 4000r/min离心10min，回收细 胞，用冰冷的0.1mol/LCaCl2lml悬浮细胞，每20(^1—份分装细胞，此细胞为感受态细胞。 向20(^1感受态细胞中加入质粒DNA (即连接质粒pBE2R-a/ rN)l貼，冰浴30min，然后42。C 水浴保温90s,冰浴2min，加入80(^1 LB液体培养基，37'C慢摇lh，涂布含有氨苄青霉素 (100pg/ml)的LB平板，37。C培养12-16h。收集平板上长出的菌落于5ml LB液体培养基试 管中(含有100pg/ml氨苄青霉素)，37。C振荡培养，采用生工生物工程(上海)有限公司 小量质粒提取试剂盒提取质粒，得到大量扩增的连接质粒pBE2R-";^N，用于转化枯草芽 孢杆菌Baci//^ WB600。
(3) 枯草芽孢杆菌万""7/附sw6"/h WB600的转化
挑取新鲜的枯草芽孢杆菌S"c///^ WB600单菌落至3ml SPI培养基中，37°C、 250
r/min培养过夜。次日取100tU培养液转接至5ml SPI培养基，37°C、 250 r/min培养至对数生 长末期(OD,约为0.9)，再转接0.2m塘养液至2mlSPII培养基中，37°C、 150r/min培养90 min。分装成0.5ml每管，加入l吗质粒(即连接质粒pBE2R-"j^N)，再于37。C、 100r/min 振荡培养30min，然后250r/min培养90min，得到转化子，离心倾去部分上清液，保留100pl 上清液与菌液混合均匀后涂布筛选平板，通过卡那霉素抗性平板筛选转化子。
(4) 突变文库的筛选
具有不同特性碱性蛋白酶基因的筛选用无菌牙签将转化子和对照菌枯草芽孢杆菌 Sac/〃M WB600-pBE2R点种在含l。/o脱脂乳的LB平板(含30昭/ml卡那霉素)上，
5(TC培养12-16h。将平板上长出并产生蛋白水解圈的转化子采用96孔板高通量复筛，复筛 底物为N-succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide (AAPF)。将平板上用于复筛的单细胞克隆接入5ml2xYT液体培养基试管中(含有30吗/ml卡那霉素)，于37。C、 180rpm过夜培养。 发酵液离心，取10W上清液，100pl含50mMTris-HCl， 10mMCaCl2， 100mMNaCl， 0.2 mM AAPF (pH8.5) ， 5(TC反应lmin，加入10(^1苯甲基磺酰氟终止酶活，于410nm检测产物的 吸收值。选择将底物AAPF转化成产物能力高的转化子用于下一轮error-prone PCR。
重复2轮步骤(1)(2)(3)，其中第二轮转化子和对照菌枯草芽孢杆菌Sfl"7/w w^/fo WB600-pBE2R培养的温度降至45。C ，第三轮转化子和对照菌枯草芽孢杆菌^^7/w wto'fo WB600-pBE2R培养温度降至4(TC，过程示意图见附图3。
(5)DNA shuffling
将筛选到的具有不同特性的碱性蛋白酶基因各3ng混合，用DNaseI片段化，采用50pl 体系ddH20 8pl， 10xDNase I buffer 5(il， DNA各3ng， DNase I 0.05U，将上述反应体系 于15'C反应20min，于85'C水浴中保温30min，以终止DNase I酶活。于2%琼脂糖凝胶电泳 检测片段化产物，结果见附图4。将DNase I片段化的产物用DNA片段纯化试剂盒Ver.2.0 (TaKaRa)纯化回收作为无引物PCR的模板。
无引物PCR的反应体系为ddH20 21pl, 10xbuffer2.5W， dNTPlpl，模板10ng， 7bg 酶0.25U。无引物PCR扩增程序94'C预变性lmin， 94'C变性30s、 (TC退火30s、 72'C延伸 90s、反应50个循环，72'C延伸5min。将无引物PCR产物稀释1(^倍，作为有引物PCR的模 板。
有引物PCR反应体系为5(Hil: ddH20 39pl、 10xbuffer5pl、 dNTP2pl、上游引物 (10pmol尔l) 1^1、下游引物(10pmol/pl) 1^1、模板10ng、 7b《酶0.5U。 PCR扩增程序 94。C预变性lmin,94。C变性30s、57。C退火30s、72。C延伸90s、反应30个循环，72。C延伸5min。 PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，在约810bp处出现特异性条带。片段化过程及两歩骤PCR 过程的电泳图如附图4所示。
3、表达载体的构建以及含有低温碱性蛋白酶基因的工程菌的构建和筛选
(1) 将有引物PCR产物纯化回收后，用脸oI和SamHI双酶切，酶切产物与质粒pBE2R的 相同酶切产物，采用DNA连接试剂盒Ver.2.0 (TaKaRa) 16'C连接6h，将连接后的质粒转 化到五.co// DH5a中，筛选阳性转化子，提取阳性转化子中的质粒转化到枯草芽孢杆菌 Sad〃M swto'fcWB600中，构建基因突变文库。
(2) 将枯草芽孢杆菌5a"7/船^to'foWB600的转化子及对照菌枯草芽孢杆菌3a"7/w s"to7k WB600-pBE2R点种含P/。脱脂乳的LB (含30jxg/ml卡那霉素)平板，于3(TC培养 12-16h,挑取产生水解圈的转化子用于复筛。将平板上的单细胞克隆接入5ml2xYT液体培 养基试管中(含有30pg/ml卡那霉素)，于37°0、 180rpm过夜培养。发酵液离心，取10pl 上清液，100pil含50mMTris-HCl、 10mMCaCl2、 100mMNaCl、 0.2 mM AAPF (pH8.5), 3(TC反应lmin，加入lO(Hil苯甲基磺酰氟终止酶活，于410nm检测产物的吸收值，从中筛 选出一株产低温碱性蛋白酶的转化子并命名为Saa'//^ ^to'fc WB600-TC4。
(3) 测序经过测序得到该工程菌编码低温碱性蛋白酶成熟肽基因的特征为长度810bp、核酸 DNA、单链、线性、序列描述SEQIDNo.2。 4、低温碱性蛋白酶的制备、纯化
(1) 发酵和盐析
将工程菌Sa"7/wsWB600-TC4接入LB培养基(含30昭/ml卡那霉素)，37°C、 180r/min振荡培养12-16h。取100ml发酵液，4°C、 8000r/min离心20min，收集上清，边 搅拌边加入研细的固体硫酸铵使其饱和度达到70%, (C静置过夜。4'C、 8000r/min离心 20min，蛋白沉淀溶于适量PBS (pH7.6)缓冲液中。
(2) 脱盐
将盐析所得沉淀物溶液装入透析袋，将透析袋放入10倍该溶液体积的PBS (pH7.6)缓 冲液中，4。C透析。4°C、 8000r/min离心20min，取上清液。
(3) Sephadex G-50柱层析
Sephadex G-50层析柱(1.6 cm x 60 cm)用PBS缓冲液(pH7.6)平衡，将脱盐后的上 清液上柱，用相同的缓冲液进行洗脱，以部分收集器收集流出液，缓冲液流速为lml/min， 收集速度为4min/管，收集活性组分。
以下是对重组碱性蛋白酶的基本性质的检测
(1) 酶活测定方法
酶活单位定义将lml酶液在pH10.5，每分钟水解酪蛋白产生l)ag酪氨酸所需的酶量定 义为一个酶活力单位(U/ml)。
碱性蛋白酶酶活力测定方法采用Folin法。用硼砂/NaOH(pH 10.5)缓冲液配制1%的酪素 溶液作为底物并将酶液稀释适当的倍数。取lml稀释的酶液，于一定温度下保温2min，加 入同样温度的底物lml，反应10min，加入2ml 10%三氯乙酸终止反应。静置离心，取Iml 上清液，加入5ml0.4mol/LNa2CO3溶液、lml福林酚试剂，混匀，相同温度下保温20min， 于680nm波长，用10mm比色皿测其吸光度(X)。以灭活酶液为对照。
酶活力计算公式X=AxKx4/10xn=0.4xAxK>n
式中X—样品的酶活力(U/ml) ; A—样品平行试验的平均吸光度；K一吸光常数， 取97; 4—反应试剂的总体积(ml) ; IO—反应时间(min) ， n—稀释倍数。所得结果表 示至整数，平行实验相对误差不得超过3%。
(2) 重组碱性蛋白酶的性质
I .最适作用pH:用不同pH的缓冲液柠檬酸/柠檬酸钠(pH5.0-6.0) 、 Na2HP04/NaH2P04 (pH7.0-8,0)、硼砂/NaOH (pH9.0-11.0) 、 Na2HP04/NaOH (pHl 1.0-12.0)配制1%的酪素 溶液并稀释粗酶液。取lml稀释酶液于4(TC测定酶活，以确定酶的最适作用pH，见附图5。
II.最适作用温度将酶液分别在2(TC、 30°C、 40°C、 50°C、 60'C、 7(TC水浴中保温2min 后测定酶活，以确定酶的最适作用温度，见附图6。SEQUENCE LISTING
〈110〉天津科技大学
〈120〉低温碱性蛋白酶基因、含有该基因的工程菌及二者的构建方法 <130〉 20090710 <160〉 4
<170〉 Patentln version 3.3
〈210〉 1 〈211〉 810 〈212〉 DNA
〈213〉碱性蛋白酶成熟肽基因aprN 〈400〉 1
gcgc犯tcag tgccatgggg肪ttagccgt gtgcaagccc c柳tgccca taaccgtgga 60
ttgacaggtt ctggtgtaaa agttgctgtc ctcgatacag gtatttccac tcatccagac 120
ttaaatattc gtggtggcgc tagctttgta ccaggggaac catccactca agatgggagt 180
gggcatggca cgcatgtggc cgggacgatt gctgctttaa acaattcgat tggcgttctt 240
ggcgtggcgc cgagcgcgga^ actotacgct gtt犯3gt3t taggggcg兆cggttcsggt 300
tcggtcagct cgattgccca aggattgg犯tgggcaggga ac組ggcat gcacgttgct 360
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acttctagag gcgttcttgt tgtagcggca tctgggaatt caggtgcagg ctcaatcagc 480
tatccggccc gttatgcgaai cgcaatggca gtcggagcta ctgaccaaaa c犯c犯ccgc 540
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<213>低温碱性蛋白酶基肉 <400〉 2
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<400> 4
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1权利要求
1、一种低温碱性蛋白酶基因，其特征在于其基因序列描述如SEQ ID No.2，序列特征为810bp，核酸，单链，线性，DNA。
2、 根据权利要求l所述的一种低温碱性蛋白酶基因，其特征在于所述基因的源基 因是从嗜碱芽孢杆菌(5ac/〃M a/ca/op/n7瓜 ATCC 21522)中获得的。
3、 一种如权利要求l所述的低温碱性蛋白酶基因的构建方法，其特征在于构建的步骤是(1) 碱性蛋白酶成熟肽基因的获得；(2) 碱性蛋白酶成熟肽基因的定向改造，以获得碱性蛋白酶的基因文库；(3) 表达载体构建以及含有低温碱性蛋白酶基因的工程菌的构建以及筛选；(4) 筛选得到目的菌株后进行测序，得到该基因序列。
4、 一种含有如权利要求1所述低温碱性蛋白酶基因的产低温碱性蛋白酶工程菌，其 特征在于该工程菌含具有产低温碱性蛋白酶的特性。
5、 一种如权利要求4所述产低温碱性蛋白酶工程菌的构建方法，其特征在于方法 的步骤包括(1) 碱性蛋白酶成熟肽基因的获得；(2) 碱性蛋白酶成熟肽基因的定向改造，以获得碱性蛋白酶基因文库；(3) 表达载体构建以及含有低温碱性蛋白酶基因的工程菌的构建以及筛选。
6、 根据权利要求5所述的一种产低温碱性蛋白酶的工程菌的构建方法，其特征在于-所述歩骤(2)中碱性蛋白酶成熟肽基因的定向改造方法采用error-prone PCR和DNA shuffling 。
7、 根据权利要求5所述的一种产低温碱性蛋白酶工程菌的构建方法，其特征在于所述步骤(3)中表达载体为pBE2R， pBE2R是一种大肠-枯草穿梭分泌表达型载体，含有一 个强启动子P43启动蛋白酶基因的转录， 一个嗜碱芽孢杆菌碱性蛋白酶信号肽用于指导 菌体中合成的蛋白酶分泌至胞外。
8、 根据权利要求5所述的一种产碱性蛋白酶工程菌的构建方法，其特征在于所述 步骤(3)中构建工程菌的宿主菌为枯草芽孢杆菌万"d/ZM w6"fe WB600，该菌为6种胞外 蛋白酶缺失菌株。
9、 一种由权利要求4所述产低温碱性蛋白酶工程菌发酵生产的低温碱性蛋白酶，其 特征在于该酶的成熟肽碱基序列为SEQIDNo.2，最适作用温度为3(TC，最适作用pH 为11.0。
全文摘要
本发明涉及一种低温碱性蛋白酶基因、含有该基因的工程菌及二者的构建方法以及低温碱性蛋白酶，低温碱性蛋白酶基因序列描述如SEQ ID No.2，序列特征为810bp，核酸，单链，线性，DNA。产低温碱性蛋白酶的工程菌由宿主菌枯草芽孢杆菌BacillussubtilisWB600转化而来，具有产低温碱性蛋白酶的特性，构建工程菌的步骤包括该方法包括目的基因的获得、目的基因的定向改造、表达载体构建、含有低温碱性蛋白酶基因的工程菌的构建以及筛选。低温碱性蛋白酶的成熟肽碱基序列见SEQ ID No.2，其最适作用温度为30℃，最适作用pH为11.0。该工程菌所产碱性蛋白酶最适温度为30℃，最适pH为11.0，为洗涤剂中添加使用的低温碱性蛋白酶提供了理论基础，具有重要的经济效益和社会效益。
文档编号C12N15/75GK101597615SQ20091006967
公开日2009年12月9日 申请日期2009年7月10日 优先权日2009年7月10日
发明者堃 成, 梁晓梅, 王建玲, 王春霞, 路福平, 明 黎 申请人:天津科技大学