专利名称：新型果糖基转移酶固定化方法
技术领域：
本发明涉及果糖基转移酶新型固定化方法。
背景技术：
固定化酶技术在生物化工中应用可使酶重复使用，易于与底物、产物分离，减少工艺环 节，同时还有助于酶促反应的连续和自动化操作，从而降低生产成本，因此，该技术在实际 生产中扮演着非常重要的角色。
低聚果糖，如蔗果三糖、蔗果四糖及蔗果五糖等，具有调节人体血脂及肠道有益菌群功 能，是对人体健康非常有益的一类功能性糖类化合物。目前，低聚果糖生产主要是通过液态 果糖基转移酶催化来实现，为降低其生产成本，促进低聚果糖生产，对其固定化酶技术^f究 引起了人们广泛关注。
选择一种合适载体通过交联法固定化酶可使酶与载体连接更为牢固，稳定性更好。基于 对壳聚糖无毒性、良好凝胶性及生物兼容性等物化性能充分认识，吸附性能强的壳聚糖微球 为载体的固定化酶研究近年来备受关注。广西大学魏远安课题组通过向壳聚糖酸性溶液中加 入强碱溶液制备壳聚糖无定形颗粒，然后向经过处理得到的壳聚糖中性颗粒中加入交联剂和 相应的酶，得到固定化的果糖基转移酶；上海大学雍克岚课题组用三氯氧磷作交联剂，将a-葡萄糖苷酶固定于壳聚糖上；浙江大学屠幼英课题组将多酚氧化酶包埋在壳聚糖、海藻酸盐 和琼脂材料上，然后用戊二醛和无水丁烯二酸-乙烯进行交联。
目前，我国大多采用一步交联法固定化酶，即同一体系中交联剂与酶和载体反应，此外， 载体形状不规则性，这些都将导致有机大分子物质作为固定化酶载体的机械强度低，反应 过程易碎，酶负载量较少，固定化酶的利用率低等缺点，从而限制固定化酶的使用。
发明内容
针对上述现有技术存在的不足之处，本发明的目的是提出一种新型果糖基转移酶固定化
方法，通过滴丸机将含有粘合剂聚乙烯吡咯烷酮的壳聚糖醋酸溶液滴加到乙醇调节过的
NaOH溶液中，制备得到颗粒形状均一、机械强度好的壳聚糖球形颗粒，并以此为载体，通
过与交联剂两步反应，固定了果糖基转移酶，提高了壳聚糖作为固定化酶载体的机械强度，
提高了酶负载量。采用此方法制备的固定化酶，可多次重复使用。
3本发明设计思路是要求提高果糖基转移酶被固定化的载体的机械强度，增加固定化酶酶 活，提高重复使用率。
本发明按以下步骤进行操作
A、 利用机械法对菌丝体进行处理，制备得果糖基转移酶菌液；
B、 向浓度2%的壳聚糖醋酸溶液中按体积比加入0.01%~0.05%粘合剂聚乙烯吡咯垸酮；
C、 用滴丸机将B步骤得到的壳聚糖乙酸溶液滴加到乙醇调节过的氢氧化钠溶液中，制 备颗粒形状均一，直径为2.5mm 3.5mm、机械强度好的壳聚糖球形颗粒，并将其洗至中性；
D、 将中性壳聚糖球形颗粒浸泡在磷酸缓冲液中，向含有中性壳聚糖球形颗粒的磷酸缓 冲液中按体积比0.1%~0.3%加入戊二醛交联剂，使之键合在壳聚糖球形颗粒上，轻轻振动2 个小时后，用去离子水充分洗涤至除去未键合戊二醛交联剂；
E、 将键合了戊二醛的壳聚糖球形颗粒置于pH:7磷酸缓冲液，然后向其中加入果糖基 转移酶菌液进行固定化。
本发明所述步骤A中机械法处理菌丝体为取发酵菌丝体用自来水冲洗三次以去除培养 基中的色素等杂物。该歩骤如果是发酵罐中的菌丝体，在离心的时候可以用三倍体积的水进 行冲洗；如果己经取出的菌丝体，可以用二倍体积的水重悬之后，再进行抽滤；加入pH为 7.0， 0.02M磷酸缓冲液，比例为l: 4，利用机械，如胶体磨、球磨机、雷蒙磨等处理菌丝体， 充分混匀。将研磨后的菌丝体利用高压均质机进行均质。压力大于0.5 1.5MPa，期间温度保 持为0 5 °C。将破碎的细胞液进行收集得到果糖基转移酶菌液，测定其酶活，将菌液离心， 1000 4000r/min， 10 30分钟，取上清，测酶活及体积。测离心沉淀的酶活及重量。
本发明所述步骤B为称取0.01%~0.05%聚乙烯吡咯垸酮加入到2%壳聚糖醋酸溶液中。
本发明所述步骤C为用滴丸机将含0.01%~0.05%聚乙烯吡咯垸酮的2%壳聚糖醋酸溶 液滴加到乙醇调节过的1M氢氧化钠溶液中，调节后乙醇质量百分含量为25%~35%。将获得 的壳聚糖球形颗粒过滤并用蒸馏水充分洗涤直至中性。
本发明所述步骤D为将固定化酶载体利用pH为7.0的磷酸缓冲液重悬，其中作为湿载 体的壳聚糖球形颗粒与磷酸缓冲液的比例为质量比为1:8。湿载体的活化通过加入0.1%~0.3% 的戊二醛交联剂，轻轻振动2个小时，然后用去离子水将多余的戊二醛交联剂洗掉。
本发明所述步骤E为将壳聚糖球形颗粒以l: IO质量比重悬于浓度介于12 50U/ml果 糖基转移酶液中，16'C固定10小时，得固定化酶颗粒，利用去离子水洗涤以除去游离酶，得 到固定化果糖基转移酶。本发明与现有方法技术相比，具有如下实质性特点
1. 本发明向壳聚糖醋酸溶液中加入了 0.01%~0.05%粘合剂聚乙烯吡咯烷；
2. 本发明充分利用了滴丸机及乙醇调节了 NaOH碱液，此条件下制备的壳聚糖颗粒形状均 一，直径在2.5mm 3.5mm,机械强度好；
3. 交联和固定分阶段进行，大大提高了果糖基转移酶的负载量，增加了酶活。 本发明以壳聚糖球形颗粒为载体，通过与交联剂两步反应，固定了果糖基转移酶，克服
了传统一步法固定化酶不足，其颗粒形状均一，直径在2.5mm 3.5mm，机械强度好，表面积 大，大幅度提高了酶负载量，增强了酶活，酶活力回收率平均达到了 85%，壳聚糖球形颗粒 固定化酶循环使用次数达到50次以上，降低了游离酶的反应成本。此外，本发明工艺简单， 生产设备投资少；在低聚果糖生产过程中能有效提高低聚果糖生产效能，降低低聚果糖生产 成本。
具体实施例方式
以下通过具体实施实例来说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围不仅限于此。
实施例一
用滴丸机将含0.01%粘合剂聚乙烯吡咯烷酮的2%壳聚糖醋酸溶液滴加到乙醇调节过的 1M氢氧化钠溶液中，将获得的壳聚糖球形颗粒过滤并用去离子水充分洗涤直至中性。
将固定化酶载体利用pH为7.0的磷酸缓冲液重悬，其中湿载体与缓冲液的比例为质量比 为h 8。载体的活化通过加入0.1%的交联剂，轻轻振动2个小时，然后用去离子水将多余的 交联剂洗掉。
将壳聚糖球形颗粒以l: IO质量比重悬于浓度介于12U/ml果糖基转移酶液中，16'C固定 IO小时，得固定化酶颗粒，利用去离子水洗涤以除去游离酶，得到固定化果糖基转移酶。测 其活力为40U/g，按lkg 52。/。蔗糖溶液与40g固定化果糖基转移酶比例进行酶化反应，在50 'C反应8h，得到低聚果糖溶液用过滤法回收固定化果糖基酶，低聚果糖溶液经板框压滤后， 再经浓縮，得到复合标准的低聚果糖。
实施例二-
用滴丸机将含0.03。/。聚乙烯吡咯垸酮的2。/。壳聚糖醋酸溶液滴加到乙醇调节过的lM氢氧 化钠溶液中，将获得的壳聚糖球形颗粒过滤并用去离子水充分洗涤直至中性。
将固定化酶载体利用pH为7.0的磷酸缓冲液重悬，其中湿载体与缓冲液的比例为质量比 为l: 8。载体的活化通过加入0.15%的交联剂，轻轻振动2个小时，然后用去离子水将多的交联剂洗掉。
将壳聚糖球形颗粒以l: 10质量比重悬于浓度30U/ml果糖基转移酶液中，16。C固定10 小时，得固定化酶颗粒，利用去离子水洗涤以除去游离酶，得到固定化果糖基转移酶。测其 活力为80U/g，按lkg 52%蔗糖溶液与20g固定化果糖基转移酶比例进行酶化反应，在5(TC 反应10h，得到低聚果糖溶液用过滤法回收固定化果糖基酶，低聚果糖溶液经板框压滤后， 再经浓縮，得到复合标准的低聚果糖。
实施例三
用滴丸机将含0.05n/。聚乙烯吡咯烷酮的2。/。壳聚糖醋酸溶液滴加到乙醇调节过的lM氢氧 化钠溶液中，将获得的壳聚糖球形颗粒过滤并用去离子水充分洗涤直至中性。
将固定化酶载体利用pH为7.0的磷酸缓冲液重悬，其中湿载体与缓冲液的比例为质量比 为l: 8。载体的活化通过加入0.3%的交联剂，轻轻振动2个小时，然后用去离子水将多余的 交联剂洗掉。
将壳聚糖球形颗粒以l: 10质量比重悬于浓度介于50U/ml果糖基转移酶液中，16。C固定 IO小时，得固定化酶颗粒，利用去离子水洗涤以除去游离酶，得到固定化果糖基转移酶。测 其活力为50U/g，按lkg 52y。蔗糖溶液与25g固定化果糖基转移酶比例进行酶化反应，在50 'C反应8h，得到低聚果糖溶液用过滤法回收固定化果糖基酶，低聚果糖溶液经板框压滤后， 再经浓縮，得到复合标准的低聚果糖。
权利要求
1、一种新型果糖基转移酶固定化方法，其特征在于包括下列步骤(1)向壳聚糖醋酸溶液中加入0.01％～0.05％粘合剂聚乙烯吡咯烷酮；(2)将上述壳聚糖醋酸溶液滴加到乙醇调节过的NaOH溶液中，制备壳聚糖球形颗粒，并将壳聚糖球形颗粒用蒸馏水洗涤至中性；(3)将中性壳聚糖球形颗粒置于pH＝7的磷酸缓冲液中，加入戊二醛交联剂，使之键合在壳聚糖球形颗粒上，并充分洗涤，以除掉未键合的戊二醛；(4)将键合了戊二醛的壳聚糖球形颗粒置于pH＝7磷酸缓冲液，然后向其中加入果糖基转移酶，使之固定化。
2、 如权利要求书1所述的新型果糖基转移酶固定化方法，其特征在于向浓度为2%壳聚糖醋酸溶液中加入0.01%~0.05%粘合剂聚乙烯吡咯烷酮。
3、 如权利要求书1所述的新型果糖基转移酶固定化方法，其特征在于所述壳聚糖球形颗粒的制备是通过滴丸机将含0.01% 0.05%粘合剂聚乙烯吡咯烷酮的壳聚糖醋酸溶液滴加到乙醇调节过的1MNaOH溶液，调节后的乙醇质量百分含量为25%~35%。
4、 如权利要求书1所述的新型果糖基转移酶固定化方法，其特征在于所述壳聚糖球形颗粒直径在2.5mm ~3.5mm。
5、 如权利要求书1所述的新型果糖基转移酶固定化方法，其特征在于所述壳聚糖球形颗粒有利于戊二醛交联反应和果糖基转移酶的固定化。
6、 如权利要求书1所述的新型果糖基转移酶固定化方法，其特征在于所述步骤(3)的反应是，向含有中性壳聚糖球形颗粒的pH = 7磷酸缓冲液中，加入质量百分含量为0.1%~0.3%的戊二醛交联剂，将戊二醛固定在壳聚糖球形颗粒上，此条件下制备的壳聚糖颗粒可键合较大量的戊二醛。
7、 如权利要求书1所述的新型果糖基转移酶固定化方法，其特征在于所述步骤(4)的反应是，向含有键合了戊二醛的壳聚糖pHz7磷酸缓冲液中，加入浓度介于12~50U/ml果糖基转移酶，进行酶固定化，16°C，固定10h。
8、 如权利要求书1所述的新型果糖基转移酶固定化方法，其特征在于通过戊二醛交联和固化分阶段反应，将果糖基转移酶固定在壳聚糖球形颗粒上。
全文摘要
一种新型果糖基转移酶固定化方法，包括下列步骤(1)向壳聚糖醋酸溶液中加入0.01％～0.05％粘合剂聚乙烯吡咯烷酮；(2)将上述壳聚糖醋酸溶液滴加到乙醇调节过的NaOH溶液中，制备壳聚糖球形颗粒，并将壳聚糖球形颗粒用蒸馏水洗涤至中性；(3)将中性壳聚糖球形颗粒置于pH＝7的磷酸缓冲液中，加入戊二醛交联剂，使之键合在壳聚糖球形颗粒上，并充分洗涤，以除掉未键合的戊二醛；(4)将键合了戊二醛的壳聚糖球形颗粒置于pH＝7磷酸缓冲液，然后向其中加入果糖基转移酶，使之固定化；本发明固定了果糖基转移酶，提高了壳聚糖作为固定化酶载体的机械强度，提高了酶负载量；采用此方法制备的固定化酶，可多次重复使用。
文档编号C12N11/10GK101538565SQ200910094419
公开日2009年9月23日 申请日期2009年4月29日 优先权日2009年4月29日
发明者别松涛, 唐石荣, 李世平, 段进军, 毛淑红, 牟云青, 路福平 申请人:云南健生生物科技有限公司;天津科技大学