专利名称：一株抑制烟草黑胫病菌危害的链霉菌以及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株链霉菌及其用于抑制烟草黑胫病菌危害的用途，更具体地说本发明提供了抑制烟草黑胫病菌危害的保藏菌株，可大大地减轻烟草黑胫病的危害。本发明属于防治烟草黑胫病危害烟草的技术领域。
背景技术：
^ S(Phytophthora parasitica var. nicotiane) ^ van Breda de Haanl896年在印尼爪哇烟草上发现的一类卵菌病害，主要侵染烟草根部及茎基部。该病是烟草的毁灭性病害，同时也是世界烟草生产中危害最严重的病害之一。1922年便成为美国佛罗里达、堪萨斯州雪茄烟区的严重病害。1924年以后，该病已遍布于全世界温带、亚热带和热带地区烟田。目前烟草黑胫病广泛分布于我国各产烟区。据2004 2005年全国15个省(市)烟草侵染性病害调查结果，黑胫病病害严重的省(市)有安徽、重庆、四川、贵州、 湖南，其次为河南、云南、山东、福建等，并且该病多与烟草青枯病混合发生，使其危害性进一步加重。烟草黑胫病平均发病率为10% 20%，发病率高的田块达75%，严重的甚至造成绝收。据估测，2006年我国烟草因黑胫病引起的病害损失达27656. 1万元。特别是在长江以南各烟区又常常与烟草青枯病混合发生，对烟草造成的危害更加严重。该病害对烟草种植造成的产量和产值损失非常巨大，目前仅低于烟草花叶型病毒病(TMV、CMV和PVY)，居第2位。该病主要表现为烟草矮化、萎焉、叶片发黄、根和茎基部坏死，平均发病率为5%到 12%，重者损失达到75%，甚至绝收。目前主要采用选育抗病品种、轮作和药剂防治等措施来防治烟草黑胫病。在使用化学杀菌剂防治植物病害的同时，不仅相应地带来其它方面的安全问题，而且还带来对非靶标生物的影响及该病菌抗性的发展问题等。1992年“世界环境与发展大会”的第21条决议指出“要在全球范围内控制化学农药的销售和使用，到2010 年初，生物农药的产量将占农药总量的60 % ”。王荔等利用细胞工程育种在实验室已获得成功，但尚未能在生产上推广使用，转基因技术在烟草黑胫病的抗病育种应用也尚未见报道。 生产上用来防治烟草黑胫病的化学药剂多为苯基酰胺类及乙磷铝等同一种或作用机制相同的几种内吸性杀菌剂，很容易产生耐药性，从而引起药效下降，药剂用量增加。在控制烟草黑胫病的实践中，病害发生期主要采用化学药剂防治，化学药剂防治虽然发挥了重要作用并取得了明显的成效。但烟草是叶用作物，施用农药后，很容易影响品质，并且药物的残留严重危害人体健康。用微生物的代谢产物来防治植物病害，最早始见于美国、英国、日本等国，用医用抗生素如链霉素(Str印tomycin)、土霉素(Oxytertracyline)、灰黄霉(Griseofulvin)等来防治植物病害。我国农用抗生素的研究起步较晚，始于20世纪50年代初，发展迅速，至今已取得了很大的成绩。放线菌是一类极其丰富的微生物资源，其中的很多、尤其是链霉菌属能产生多种抗生素类物质，用于植物病害防治有着广阔的前景。国内外已报道的抗卵菌天然活性放线菌株主要有周成萍从海南五指山原始林区采集的土样中分离获得1株对辣椒疫霉菌具强烈抑菌活性的放线菌WZ60菌株，田间防治辣椒疫病的试验结果表明，WZ60对辣椒疫病具有 90%的优良防治效果；林壁润、谢大双等分离到1株链霉菌(Sti^ptomyces spp.)，其产生的抗生素2507(万隆霉素)对苗期的黄瓜疫病菌(Phytophthora melonis Kat. sura)具有良好的抗生作用；Samac DA等研究发现大多数产生抗生素的链霉菌菌株对苜蓿疫霉属3 个不同菌株的生长有抑制作用。其中两个菌株减少由苜蓿疫霉属真菌引起的落叶；2005年 Gil-Jae Joo分离得到一株链霉菌EF-76产生格尔德霉素。研究发现其重组菌株FP44对蜡样芽孢杆菌ATCC 14579及疫霉病菌有较强的拮抗性；2007年阿里玛斯等从植物的根部、 茎部和叶片中分离到内生放线菌菌株gCLA4，该菌株的无菌滤液能够强烈抑制病菌孢子囊的形成及游动孢子的释放，并且对其菌丝生长也有明显的抑制作用。疏秀林，安德荣通过黄瓜霜霉病孢子萌发试验和离体叶片抑菌试验研究发现，瑞拉菌素产生菌S-5120菌株和瑞拉菌素均对黄瓜霜霉病有较强抑制作用。刘乐涛等在2008年从辣椒根际土壤中筛选出对辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)有拮抗作用的放线菌A10，该菌株对孢子囊萌发的抑制率达到89. 3%。生防菌防病原理为直接拮抗烟草黑胫病病原，有一部分生防菌还可以诱导烟草对黑胫病产生抗性，生物药剂如果适时施用，对于病害的防治可以起到一个长期的防病效果， 虽然生防菌在生物防治中的应用刚起步，但已有一些良好的进展。利用生防菌防治烟草黑胫病，不仅可以保护环境，并且也不会使黑胫病菌的产生抗药性，对植物本身也不会产生任何危害为害。烟草黑胫病的生物防治是保障烟草可持续发展的一项重要技术，选用少量低毒高效、无残留的生物农药杀死或抑制病原菌。为研究开发新型生物农药提供资源，烟草黑胫病的生物防治呈现良好前景。
发明内容
本发明针对烟草的毁灭性病害-烟草黑胫病，提供一株生防活性的保藏菌株，通过抑制其病原菌的生长，从而有效控制该病害在烟草上的危害，提高烟草的产量和品质。因此，本发明第一个发明目的是提供一株链霉菌株D35，其中所述菌株已于 2009年08月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号 CGMCCNo. 3250。在一个具体实施方案中，所述的链霉菌株D35的生理学特征是(1)该菌株在高氏一号培养基(可溶性淀粉20g、K2HPO4O. 5g、KN03lg、 FeSO4 · 7Η200· Olg、NaCl 0. 5g、MgSO4O. 5g、琼脂 20g、蒸馏水 1000mL、PH7. 2.)上生长，菌落紧密、多皱、崎岖，皮壳状，紫褐色，气生菌丝和基内菌丝均很丰富，气生菌丝体形成孢子链， 孢子呈紫灰色；(2)在高氏一号液体培养基(可溶性淀粉20g、K2HPO4O. 5g、KN03lg、 FeSO4 ·7Η200. Olg,NaCl 0. 5g、MgS040. 5g、蒸馏水 1000mL、PH7. 2.)中生长产生褐色的色素；(3)D35菌株能利用L-阿拉伯糖、D-阿拉伯糖、葡萄糖、果糖、蔗糖、鼠李糖、棉子糖以及甘露糖、麦芽糖；(4)菌株不能使明胶液化、淀粉水解，不能分解纤维素，但能产生硫化氢；(5) 是菌株产生抗菌物质的最适生长温度，拮抗菌株在pH值5. 0 9. 0均能产生抗菌物质。
由于通过上述链霉菌株D35所获得的发酵液具有良好的抑制烟草黑胫病的效果， 因此其菌株发酵液也是另一个具体实施方案。在另一个具体实施方案中，筛选所述的菌株D35的方法包括(1)从湖南壶瓶山、华山、九寨沟等国家级自然保护区收集了 72份土壤样品，分离了 4 个放线菌菌株；(2)以烟草黑胫病菌(卵菌)为指示菌，采用平板对峙生长法对各菌株拮抗活性进行筛选，得到一个抗菌活性高的放线菌菌株D35 ；(3)菌株发酵液经细菌过滤器过滤后，在每个培养皿加入3mL滤液(稀释5倍)；(4)选取对烟草黑胫病菌菌丝抑制率高的菌株，其中优选抑制率为80. 3%的菌株。本发明第二个发明目的是提供一种利用上述菌株用于防治烟草黑胫病的方法。在一个实施方案中，所述的方法包括(1)培养上述菌株D35，获得菌株发酵液；(2)在烟草黑胫病的发病初期，使用上述的发酵液直接喷雾于烟草，以防治烟草黑胫病的发生。在一个具体实施方案中，步骤2中优选使用稀释25或50倍的发酵液进行喷雾。在另一个实施方案中，所述的方法包括(1)培养上述菌株D35，获得菌株发酵液；(2)当烟草移栽成活后，使用上述菌株发酵液，对烟草进行灌根，以预防烟草黑胫病的发生。在另一个具体实施方案中，步骤2中优选使用稀释2、5、10倍的发酵液进行灌根。本发明第三个发明目的是保护利用上述菌株用于提高烟草产量和品质的用途。在一个具体实施方案中，利用上述菌株制备发酵液，或直接利用菌株发酵液，通过前述的直接喷雾法或灌根法，来抑制烟草黑胫病菌在烟草体内的扩散，从而减少烟草发病率，以实现提高烟草产量和品质的用途。技术效果1.本发明的链霉菌菌株，能够有效抑制其病原菌的生长，从而有效控制该病害在烟草上的危害，提高烟草的产量和品质；2.本发明的链霉菌菌株，选用发酵液稀释5倍与培养基混勻后，对烟草黑胫病菌的抑制率80. 3% ；3.本发明的链霉菌菌株，选用发酵液稀释25、50倍喷雾时，对烟草黑胫病的防效作用分别为86. 8%和65.8% ；4.本发明的链霉菌菌株，选用发酵液稀释2、5、10倍灌根时，对烟草黑胫病的防效作用分别为57. 5%、55%和47. 5%。
具体实施方案实施例1 链霉菌株D35的筛选从湖南壶瓶山、华山、九寨沟等国家级自然保护区收集了 72份土壤样品，采用高氏一号培养基进行筛选，筛选到4 个菌株，逐一进行平板拮抗实验，得到黑胫病菌抑制菌株，进行生测实验。将分离纯化的菌株D35接种于高氏一号液体培养基。下摇瓶发酵60h，用细菌过滤器过滤发酵液。在每个无菌培养皿中加入过滤液3mL，倒入PDA培养基 (55°C左右)，摇勻，制成平板，待培养基冷却后，用无菌打孔器将培养在PDA上的病原菌打成4 5mm的小菌块，倒置移放到平板中央。重复3次。静置Ih后放入温箱，28°C下培养 5d。用十字交叉法测量菌块直径，并观察抑菌圈透明程度和边缘整齐程度。实施例2 链霉菌株D35的生理生化特征及其保藏将筛选的菌株于2009年08月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCCNo. 3250。该菌株的生理学特征D35菌株具有典型的链霉菌属的特征，在高氏一号培养基上生长，菌落紧密、多皱、 崎岖，皮壳状，紫褐色。气生菌丝和基内菌丝均很丰富，气生菌丝体形成孢子链，孢子呈紫灰色，在高氏一号液体培养基中生长产生褐色的色素。D35菌株能利用L-阿拉伯糖、D-阿拉伯糖、葡萄糖、果糖、蔗糖、鼠李糖、棉子糖以及甘露糖、麦芽糖。菌株不能使明胶液化、淀粉水解，不能分解纤维素，但能产生硫化氢。是菌株产生抗菌物质的最适生长温度，拮抗菌株在pH值5. 0 9. 0均能产生抗菌物质。该菌株的鉴定根据放线菌16S rDNA的结构特点及其保守区设计特异引物，正向引物 16sF :AGAGTTTGATCCTGGCTCAG ；反向引物 16sR :AAGGAGGTGATCCAGCCGCA。由上海生物工程公司合成。以基因组DNA为模板，采用PCR方法25 μ L反应体系扩增16S rDNA, PCR扩增条件为94°C预变性5min ；94°C变性lmin，56°C复性lmin，72°C延伸2min，25个循环；72°C 延伸8min。采用1.0%的琼脂糖对PCR扩增产物电泳检测。采用北京赛百盛基因技术有限公司硅胶模型TMPCR产物纯化试剂盒，进行PCR扩增产物的回收。天根生化科技(北京)有限公司PGM-T克隆试剂盒进行PCR扩增产物的连接以及连接产物的转化。将转化好的菌体液体培养，送上海生工测序。经测序获得菌株16S rDNA序列，通过互联网，将序列提交NCBI 数据库，应用BLAST与数据库中已有的放线菌16S rDNA序列进行相似性比较分析。菌株D35的16S rDNA核苷酸序列长为1440bp，将其与BLAST搜索到的相近菌株进行16S rDNA序列比较，用MEGA软件以相近序列构建系统发育树。结果表明D35的16S rDNA序列与三泽链霉菌(Sti^ptomyces misawanensis)的16S rDNA序列同源性非常高， 达99%。结合形态学特征、培养特征和生理生化特征分析，将其鉴定为链霉菌属的三泽链霉菌。实施例3 链霉菌株D35发酵液的制备(1)菌株的培养配制高氏一号斜面培养基，接种，放入培养箱中培养72小时，保存备用。(2)制备发酵液配制摇瓶培养基(即高氏一号培养液)，灭菌前分装三角瓶 (500mL瓶、装IOOmL液)，常规灭菌，冷却后在超净工作台上，用水洗法直接洗下斜面菌体接入发酵三角瓶中，摇瓶培养，280C，200r/min,培养48h。马上转入发酵罐发酵，参照发酵罐培养基的配制(配方可溶性淀粉 30g、K2HPO4O. 5g、KNO3Ig> FeSO4 · 7H20 0. Olg、NaCl 0. 5g、 MgSO4O. 5g、蛋白胨10g、蒸馏水1000mL、PH7. 2.)，灭菌，冷却后接种与发酵，28°C，200r/min， 培养60h中止发酵，马上用罐装塑料袋包装发酵液。实施例4 链霉菌株D35菌体及其发酵液用于在室内培养基平板上抑制烟草黑胫病菌的工艺D35菌体抑制烟草黑胫病菌的工艺用打孔器将烟草黑胫病菌打成5mm小菌块，在燕麦培养基平板中央放置烟草黑胫病菌菌块，在距离中央3. 5cm的圆周上等距离接种菌株 D35的菌体。放入25°C温箱培养3 5天。观察抑菌圈大小，透明程度和边缘整齐程度。其中，用菌株D35的发酵液与培养基混勻后抑制烟草黑胫病菌的工艺在下发酵培养60小时。培养好的发酵液首先用IOmL离心管分装，在冷冻离心机中15000rpm 离心10分钟，然后用细菌过滤器过滤得到培养滤液。测定抗菌活性时，在每个无菌培养皿中加入3mL培养滤液与燕麦培养基混勻，制成平板，平板培养基冷却后，将事先裁取的直径 5mm的菌饼倒置移入平板中央。静置Ih后放入温箱中培养，每个重复3次。待对照全部长满，用十字交叉法测量菌饼直径，并观察透明程度和边缘整齐程度，记录结果并按下式计算抑制率菌落直径=相垂直的两直径的平均值-菌饼直径抑制率(％)=(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-菌饼直径)X 100%放线菌D35菌株的发酵液对烟草黑胫病菌的生长有较高的抑制率，达80. 3%。实施例5 链霉菌株D35发酵液用于防治烟草黑胫病在烟草黑胫病的发病初期，采用D35发酵液稀释25倍直接喷雾于烟草，可抑制烟草黑胫病菌在烟草体内的扩散，防效作用可达86. 8%。或烟草移栽成活后，使用上述的发酵液稀释5倍灌根，可有效预防烟草黑胫病的发生，防效作用可达55%。表1利用喷雾法和灌根法进行防治烟草黑胫病
权利要求
1.一种具有抑制烟草黑胫病菌的三泽链霉菌D35(Mr印tomyces misawanensis)，其中所述菌株已于2009年08月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏号CGMCC No. 3250。
2.权利要求1所述的链霉菌株D35，其生理学特征是(1)该菌株在高氏一号培养基上生长，菌落紧密、多皱、崎岖，皮壳状，紫褐色，气生菌丝和基内菌丝均很丰富，气生菌丝体形成孢子链，孢子呈紫灰色；(2)在高氏一号液体培养基中生长产生褐色的色素；(3)D35菌株能利用L-阿拉伯糖、D-阿拉伯糖、葡萄糖、果糖、蔗糖、鼠李糖、棉子糖以及甘露糖、麦芽糖；(4)菌株不能使明胶液化、淀粉水解，不能分解纤维素，但能产生硫化氢；(5)是菌株产生抗菌物质的最适生长温度，拮抗菌株在pH值5. 0 9. 0均能产生抗菌物质。
3.—种通过权利要求1或2所述的三泽链霉菌D35获得的菌株发酵液及其制剂。
4.一种用于筛选权利要求1或2所述的链霉菌株D35的方法，主要包括以烟草黑胫病菌(卵菌)为指示菌，采用平板对峙生长法对各菌株拮抗活性进行筛选， 得到一个抗菌活性高的放线菌菌株D35。
5.一种利用权利要求1或2的菌株防治烟草黑胫病的方法，包括(1)培养上述菌株D35，获得菌株发酵液；(2)在烟草黑胫病的发病初期，使用上述的发酵液直接喷雾于烟草，以防治烟草黑胫病的发生。
6.权利要求5的方法，其中步骤2中优选使用稀释25或50倍的发酵液进行喷雾。
7.一种利用权利要求5的菌株防治烟草黑胫病的方法，还包括(1)当烟草移栽成活后，使用上述菌株发酵液，对烟草进行灌根，以预防烟草黑胫病的发生。
8.权利要求7的方法，优选使用稀释2、5、10倍的发酵液进行灌根。
9.一种利用权利要求1或2的菌株或权利要求3的菌株发酵液及其制剂用于提高烟草产量和品质的用途。
10.权利要求9的用途，还包括其中利用上述菌株制备发酵液或直接利用菌株发酵液， 通过前述的直接喷雾法或灌根法，来抑制烟草黑胫病菌在烟草体内的扩散，从而减少烟草发病率的方法。
全文摘要
本发明针对现有防治烟草黑胫病的不足，提供一种具有抑制烟草黑胫病菌的三泽链霉菌D35(Streptomyces misawanensis)，所述菌株已于2009年08月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC NO3250。本发明还提供了利用该菌株来有效抑制烟草黑胫病菌在烟草体内的扩散，减少发病率，提高烟草产量和品质，并有助于生物防治产品开发，进而促进该病害的安全控制。
文档编号C12R1/465GK102250781SQ20101000114
公开日2011年11月23日 申请日期2010年1月13日 优先权日2010年1月13日
发明者周倩 申请人:周倩