专利名称：镰刀菌byb2及其在微生物发酵制备阿拉伯胶酶中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株新的阿拉伯胶酶产生菌株一镰刀菌(Fusarium sp. )BYB2，及其 在微生物发酵制备L-阿拉伯糖中的应用。
背景技术：
L-阿拉伯糖属于五碳醛糖，多以阿拉伯聚糖、阿拉伯糖基木聚糖、阿拉伯糖基半乳 糖体及类似于高等植物半纤维的形式存在。L-阿拉伯糖是一种低热量的甜味剂，也是重要 的药物中间体，并且可用于生化领域中细菌培养基的制备以及香料合成等，应用范围相当 广。但是由于L-阿拉伯糖现有的生产工艺复杂，生产成本高，导致价格居高不下，阻碍了其 在食品或医药等领域的应用。目前，L-阿拉伯糖的制备方法有化学合成法和酸解法。化学合成法步骤多，工艺 复杂，原材料昂贵。酸解法对反应设备的要求较高，同时产生的混合糖成分复杂，后续分离 纯化工艺的难度较大。日本三和兴产株式会社已于2003年在中国申请了“通过酸水解生产 L-阿拉伯糖的方法”的专利，在一定程度上限制了我国采用该技术生产L-阿拉伯糖的产业 化应用。L-阿拉伯糖还可以采用酶解法，就是以阿拉伯胶为原料，采用微生物产生的水解酶 进行水解，其具有选择性强，后序处理相对简单，反应条件温和等优点，更关键的是它可以 避开日本传统酸解法制备的专利保护，是我国生产L-阿拉伯糖的工业化应用的一条途径。已见文献报道的酶法制备L-阿拉伯糖都以废弃农产品为原料，往往存在L-阿拉 伯糖的产率低、分离纯化困难等问题。阿拉伯胶是一种来源广泛的树胶，其L-阿拉伯糖的 含量高达30%以上，是自然界中L-阿拉伯糖含量最高的物质，如以阿拉伯胶为原料，酶解 阿拉伯胶生产L-阿拉伯糖的效率将明显提高。酶法水解阿拉伯胶制备L-阿拉伯糖有着底 物专一性强、产物得率高、反应条件温和等优点，适用于高纯度L-阿拉伯糖的大量制备。目 前在国内外还未见有关采用酶解阿拉伯胶制备L-阿拉伯糖的报道。采用酶解阿拉伯胶制 备L-阿拉伯糖的技术关键就是获得活力高、性能稳定的阿拉伯胶酶，而微生物是获得阿拉 伯胶酶的主要来源，适合酶的大规模工业化生产。因此，筛选产酶活力高、生长繁殖快、营养 要求低的微生物菌株发酵产酶，并用阿拉伯胶酶来水解阿拉伯胶制备L-阿拉伯糖具有重 要的理论意义和应用价值。
发明内容
本发明提供一株阿拉伯胶酶产生菌株——镰刀菌(Fusarium sp. )BYB2，及其在制 备L-阿拉伯糖中的应用，较好地克服了 L-阿拉伯糖现有的生产工艺复杂，纯度低、生产成 本高等缺点。本发明采用的技术方案是一株阿拉伯胶酶产生菌——镰刀菌(Fusarium sp. )BYB2，保藏于中国典型培养 物保藏中心，地址中国，武汉，武汉大学，430072，保藏编号CCTCC NO =M 2010087，保藏日 期:2010年4月19日。
所述镰刀菌BYB2的菌落特征如下涂布或划线接种于平板培养基上生长迅速， 30°C培养3 5d，长出粉质、粉白色、浅粉色至肉色、略带有紫色、高为3 5mm的菌落，且菌 落在形成初期呈突起絮状，菌丝白色质密。所述镰刀菌BYB2的孢子特征如下小型分生孢 子为单胞、卵形、着生方式为单生、产孢细胞为简单瓶梗，且常在瓶梗顶端聚成球团；大型分 生孢子为镰刀形、少许弯曲、分隔数多为3分隔。本发明所述镰刀菌BYB2由浙江省杭州市下城区浙江工业大学校园金合欢 (Acacia farnesiana)树下土壤中分离和筛选得到野生菌株，再经紫外线照射诱变处理获得。野生菌株的分离方法为在采集的土壤中加入阿拉伯胶进行微生物富集培养，使 得土壤中能以阿拉伯胶为唯一碳源生长的微生物数量增加，再将富集培养物稀释后涂布于 以阿拉伯胶为唯一碳源的平板培养基上，30°C培养至菌落数量不再增加，挑取平板上生长 较大的菌落接种于斜面培养基上，30°C培养3d，将进一步摇瓶复筛。用接种环分别挑取初筛的各个菌株新鲜斜面孢子2环，接入液体产酶培养基中， 30°C,200r/min振荡条件下发酵培养3d。将发酵液用滤纸过滤去除菌丝体后，取清液测酶 活力，筛选出产酶活力最高的菌株。所述的平板培养基和斜面培养基组成相同，终浓度组成为阿拉伯胶25g/L，NaNO3 3g/L，K2HPO4 lg/L，MgSO4 · 7H20 0. 5g/L，KCl 0. 5g/L，FeSO4 · 7H20 0. 01g/L，琼脂 20g/L，溶 剂为水，pH 6。所述的摇瓶筛选产酶培养基终浓度组成为阿拉伯胶25g/L，NaN033g/L, K2HPO4 lg/L, MgSO4 · 7H20 0. 5g/L, KCl 0. 5g/L, FeSO4 · 7H20 0. 01g/L，溶剂为水，pH 6。紫外线照射野生菌株诱变育种的条件为紫外照射功率为15W，照射距离为30cm， 照射时间为5 lOmin，照射次数为1 3次。本发明还涉及所述的镰刀菌BYB2在发酵制备阿拉伯胶酶中的应用。所述的应用 为将镰刀菌BYB2菌种接种至以阿拉伯胶为唯一碳源的适用于镰刀菌的常规液体产酶培 养基中，25 35°C培养45 55h，获得含有阿拉伯胶酶的发酵液。所得发酵液经过滤或离 心除去菌丝体的清液为粗酶液，可以直接应用于水解阿拉伯胶制备L-阿拉伯糖；也可以按 照常规生化方法进行酶的分离纯化，例如硫酸铵盐析、离子交换层析或凝胶过滤层析等方 法，得到纯化后的阿拉伯糖酶应用于L-阿拉伯糖的制备。所述菌株在产酶培养前，通常需要先经斜面培养活化，然后经种子扩大培养、获得 种子液再接入液体发酵培养基进行产酶培养。所述的斜面培养基终浓度组成为马铃薯150 250g/L (马铃薯去皮，切成小块加 水，煮沸30min，用纱布过滤去渣)，蔗糖或葡萄糖15 25g/L，琼脂18 22g/L，溶剂为水， pH 5 6。所述的液体种子培养基终浓度组成为阿拉伯胶20 30g/L，酵母浸出粉3 10g/L, K2HPO4O. 5 1. 5g/L, MgSO4 · 7Η20 0· 5 lg/L，溶剂为水，pH 5. 5 6. 5。所述的液体产酶培养基终浓度组成为阿拉伯胶25 35g/L，(NH4)2SO4 5 IOg/ L, K2HPO4 0. 5 1. 5g/L, MgSO4 · 7Η20 0· 5 lg/L, KC10. 5 lg/L, FeSO4 · 7H20 0. 01 0. 03g/L, H3BO3 0. 01 0. 03g/L, pH 5· 5 7。具体的，所述应用方法如下
(1)将镰刀菌BYB2菌种接种于斜面培养基，于25 30°C培养24 48h，得到活 化后的镰刀菌菌种；所述的斜面培养基终浓度组成为马铃薯150 250g/L，蔗糖或葡萄糖 15 25g/L，琼脂18 22g/L，溶剂为水，pH 5 6 ；(2)将步骤(1)活化培养后的镰刀菌BYB2孢子接种至液体种子培养基中，于25 350C、150 250r/min振荡条件下培养10 20h，得到种子液；所述液体种子培养基终浓度 组成为阿拉伯胶20 30g/L，酵母浸出粉3 10g/L, K2HPO4 0. 5 1. 5g/L，MgSO4 · 7H20 0. 5 lg/L，溶剂为水，pH 5. 5 6. 5 ；(3)将步骤(2)种子液以 10%的体积比的接种量，移种到液体产酶培养基 中，于25 35°C、150 250r/min振荡条件下培养45 55h，得到含阿拉伯胶酶的发酵 液；所述液体产酶培养基终浓度组成为阿拉伯胶25 35g/L，(NH4) 2S045 10g/L，K2HPO4 0· 5 1. 5g/L, MgSO4 · 7H20 0· 5 lg/L, KCl 0· 5 lg/L, FeSO4 · 7Η200· 01 0. 03g/L, H3BO3 0. 01 0. 03g/L, pH 5· 5 7 ；(4)将步骤(3)含阿拉伯胶酶的发酵液过滤或者离心(4000 8000r/min，10 20min)，分离除去菌丝体，所得清液即为阿拉伯胶酶的粗酶液。本发明还涉及所述的镰刀菌BYB2在水解阿拉伯胶制备L-阿拉伯糖的应用。具体的，所述的应用为以镰刀菌BYB2经发酵培养获得的阿拉伯胶酶为催化剂， 以阿拉伯胶为反应底物，在PH 4 8的缓冲溶液中、于35 60°C下进行水解反应，制得所 述L-阿拉伯糖。本发明中，测定阿拉伯胶酶活力的方法是在IOOmL三角瓶中，加入20mL浓度为 5g/L的阿拉伯胶底物溶液和ImL待测酶液，35°C、200r/min振荡酶解30min后，立即取ImL 酶解液于带刻度的试管中，加入ImL 3，5-二硝基水杨酸溶液(DNS)，置于沸水浴中5min后 用流水冷却，再定容至10mL，测波长490nm处的吸光值，根据L-阿拉伯糖的标准曲线来计算
产生的还原糖量。阿拉伯胶酶的酶活力单位定义为在一定的反应条件下，Imin产生1 μ g还原糖所 需的酶量(mL)作为一个酶活力单位(U)。本发明提供了产阿拉伯胶酶的镰刀菌BYB2，其有益效果主要体现在(1)本发明 的镰刀菌BYB2营养要求简单、容易培养；(2)镰刀菌BYB2产生的阿拉伯胶酶为胞外酶，无 需细胞破碎即可获得；(3)镰刀菌BYB2产阿拉伯胶酶活性高，在优选的发酵条件下，未经分 离纯化的粗酶液活力可达231. 6U/mL ； (4)镰刀菌BYB2产阿拉伯胶酶水解阿拉伯胶的反应 条件温和，作用时间较短，产物得率高。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此实施例1 产阿拉伯胶酶微生物的富集、分离和筛选在250mL三角瓶中加入45mL摇瓶筛选培养基，灭菌后再加入5g 土样，于30°C、 200r/min的振荡条件下培养5d，若培养过程中因水份蒸发使得培养基体积减小，则补充无 菌水至原体积。取上述培养液5mL接种于另一只灭菌后装有45mL筛选培养基的三角瓶中， 重复上述培养过程，使得能以阿拉伯胶为唯一碳源生长的微生物数量增加。
将富集培养液用无菌水稀释后涂布于平板培养基上，培养皿于30°C的生化培养箱 中培养至菌落数不再增加。观察平板上的菌落，分别挑取颜色和形态不同的菌落接种至斜 面，置于30°C培养3d，将进一步摇瓶复筛。用接种环分别挑取初筛的各个菌株新鲜斜面孢子2环，接入液体产酶培养基中， 30°C、200r/min振荡条件下发酵培养3d。将发酵液于4500r/min下离心15min后取上清液 测酶活力，筛选出产酶活力最高的菌株ZHB-306，酶活力为25. 8U/mL。所述的平板培养基和斜面培养基终浓度组成为阿拉伯胶25g/L，NaNO3 3g/L， K2HPO4 lg/L，MgSO4 · 7H20 0. 5g/L，KCl 0. 5g/L，FeSO4 · 7H20 0. 01g/L，琼脂 20g/L，溶剂为 水，pH 6。所述的摇瓶筛选培养基终浓度组成为阿拉伯胶25g/L NaNO3 3g/L, K2HPO4 lg/L, MgSO4 · 7H20 0. 5g/L, KCl 0. 5g/L, FeSO4 · 7H20 0. 01g/L，溶剂为水，pH 6。对筛选获得的菌株ZHB-306进行鉴定，将其命名为镰刀菌(Fusar iumsp.) ZHB-306。实施例2 高产阿拉伯胶酶菌株的诱变育种对实施例1筛选得到的镰刀菌ZHB-306菌株用紫外线照射诱变，筛选产阿拉伯胶 酶活力有所提高的突变菌株。紫外线照射诱变方法将菌株ZHB-306斜面菌种活化后，刮取孢子到含50mL无菌 水的三角瓶中，室温振荡20 30min，制成孢子悬液。在显微镜下用血球计数板对孢子计 数，控制孢子数量为IXlO8个/mL左右。在红光下，分别取2mL上述孢子悬液、一枚无菌回 形针至直径6cm的6只培养皿中，将培养皿置于磁力搅拌器上，在预热约20min的紫外灯下 分别照射5 lOmin。取0. 5mL上述照射处理后的孢子液，作适当稀释后分别移取0. 2mL涂 布平板。以同样操作，将未经紫外线处理的孢子液稀释涂平板作为对照，以计算致死率。用 黑布包裹所有培养皿，30°C培养3d。挑取经紫外线照射处理后致死率在90%以上的菌落转 接斜面，按实施例1所述的方法，对突变菌株进行筛选，最后获得产阿拉伯胶酶活力有所提 高的菌株ZHB05F，其产酶活力为49. 9U/mL，高于原始菌株185%。紫外灯的功率15W，照射距离为30cm。所述的平板培养基、斜面培养基和产酶培养基终浓度组成均与实施例1相同。对诱变获得的镰刀菌ZHB05F菌株重新编号为镰刀菌BYB2，提交中国典型培养物 保藏中心，保藏号CCTCC NO =M 2010087，保藏日期2010年4月19日。实施例3 镰刀菌BYB2发酵制备阿拉伯胶酶的方法以镰刀菌BYB2(CCTCC NO =M 2010087)为菌种，经过种子制备方法、产酶培养基组 成和发酵条件优化后，阿拉伯胶酶的制备方法如下(1)将冷冻干燥或试管斜面保藏的镰刀菌BYB2菌种接种于斜面培养基，斜面于 30°C生化培养箱中培养3d。所述的斜面培养基终浓度组成为马铃薯200g/L(马铃薯去皮， 切成小块加水，煮沸30min，用纱布过滤去渣)，蔗糖20g/L，琼脂20g/L，溶剂为水，pH 5 6。(2)用接种环挑取步骤(1)活化培养后的镰刀菌BYB2孢子至液体种子培养基中， 液体种子培养基于30°C、200r/min振荡条件下培养14h，得到种子液；所述液体种子培养基 终浓度组成为阿拉伯胶25g/L，酵母浸出粉10g/L, K2HPO4 lg/L, MgSO4 · 7H20 0. 5g/L，pH6. 0 ；(3)将步骤(2)种子液以9%的体积比接种量接种至液体发酵培养基，30°C、200r/ min振荡条件下培养48h，得到含阿拉伯胶酶的发酵液；所述液体发酵培养基终浓度组成 为阿拉伯胶 30g/L，(NH4)2SO4 8g/L，玉米粉 5g/L，K2HPO4 lg/L，MgSO4 · 7H20 0. 5g/L，KCl 0. 5g/L, FeSO4 · 7H20 0. Olg/L, H3BO3 0. 01/L, pH 6。(4)将步骤(3)的含阿拉伯胶酶发酵液于5000r/min、4°C条件下离心20min，倾倒 出上清液，弃去沉淀物，所得清液即为阿拉伯胶酶粗酶液，酶活力可达231. 6U/mL。实施例4 琼胶寡糖的制备 用pH为4、浓度为0. 2mol/L的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液配制3g/L的阿拉伯胶底物 溶液。15mL试管中装4mL阿拉伯胶底物溶液，加入0. 2mL实施例3阿拉伯胶酶粗酶液，保鲜 膜封口后于60°C水浴下酶解反应30min，可得未经分离纯化的L-阿拉伯糖。用高效液相色 谱法(HPLC)检测得L-阿拉伯糖浓度为530. 6mg/L。按阿拉伯胶中L-阿拉伯糖的含量为 30%计算，L-阿拉伯糖得率为59%。
权利要求
1.一株阿拉伯胶酶产生菌一镰刀菌(Fusarium sp.)BYB2，保藏于中国典型培养物保 藏中心，地址中国，武汉，武汉大学，430072，保藏编号CCTCC NO =M 2010087 ；保藏日期 2010年4月19日。
2.如权利要求1所述的镰刀菌BYB2在微生物发酵制备阿拉伯胶酶中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的应用为将镰刀菌BYB2菌种接种至以 阿拉伯胶为唯一碳源的适用于镰刀菌的液体产酶培养基中，25 35°C培养45 55h，获得 含有阿拉伯胶酶的发酵液。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述应用如下(1)将镰刀菌BYB2菌种接种于斜面培养基，于25 30°C培养24 48h，得到活化后的 镰刀菌菌种；所述的斜面培养基终浓度组成为马铃薯150 250g/L，蔗糖或葡萄糖15 25g/L，琼脂18 22g/L，溶剂为水，pH 5 6 ；(2)将步骤(1)活化培养后镰刀菌BYB2孢子接种至液体种子培养基中，于25°C 35°C、150 250r/min振荡条件下培养10 20h，得到种子液；所述液体种子培养基终浓度 组成为阿拉伯胶20 30g/L，酵母浸出粉3 10g/L, K2HPO4 0. 5 1. 5g/L，MgSO4 · 7H200.5 lg/L，溶剂为水，pH 5. 5 6. 5 ；(3)将步骤(2)种子液以 10%的体积比的接种量，移种到液体产酶培养基中，于 25 35°C、150 250r/min振荡条件下培养45 55h，得到含阿拉伯胶酶的发酵液；所述 液体产酶培养基终浓度组成为阿拉伯胶25 35g/L，(NH4)2SO4 5 10g/L，K2HPO4 0. 5 1.5g/L, MgSO4 · 7Η20 0· 5 lg/L, KCl 0· 5 lg/L, FeSO4 · 7H20 0. 01 0. 03g/L, H3BO3 0. 01 0. 03g/L, pH 5· 5 7 ；(4)将步骤(3)含阿拉伯胶酶的发酵液经过滤或者离心，分离除去菌丝体，所得清液即 为阿拉伯胶酶的粗酶液。
5.如权利要求1所述的镰刀菌ΒΥΒ2在水解阿拉伯胶制备L-阿拉伯糖中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述的应用为以镰刀菌ΒΥΒ2经发酵培养 获得的阿拉伯胶酶为催化剂，以阿拉伯胶胶为反应底物，在PH 4 8的磷酸缓冲液中、于 35 60°C下进行水解反应，制得所述L-阿拉伯糖。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述阿拉伯胶酶由如下方法获得将镰刀菌 BYB2菌种接种至以阿拉伯胶为唯一碳源的适用于镰刀菌的液体产酶培养基中，25 35°C 培养45 55h，获得含有阿拉伯胶酶的发酵液。
全文摘要
本发明提供了一株新的阿拉伯胶酶产生菌株——镰刀菌(Fusarium sp.)BYB2，及其在发酵制备L-阿拉伯糖中的应用。所述镰刀菌BYB2保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCCNoM 2010087，保藏日期2010年4月19日。本发明的有益效果主要体现在(1)本发明的镰刀菌BYB2营养要求简单、容易培养；(2)镰刀菌BYB2产生的阿拉伯胶酶为胞外酶，无需细胞破碎即可获得；(3)镰刀菌BYB2产阿拉伯胶酶活性高，在优选的发酵条件下，未经分离纯化的粗酶液活力可达231.6U/mL；(4)镰刀菌BYB2产阿拉伯胶酶水解阿拉伯胶的反应条件温和，作用时间较短，产物得率高。
文档编号C12N9/24GK101993826SQ201010259769
公开日2011年3月30日 申请日期2010年8月23日 优先权日2010年8月23日
发明者应国清, 廖青青, 易喻, 梅建凤, 王鸿, 陈建澍 申请人:浙江工业大学