专利名称：miRNA-29a化合物作为脑胶质瘤标志物的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种小分子RNA，即miRNA-29a的用途，属于生物医学材料技术领域。
技术背景
脑胶质瘤是成年人最为频发的脑肿瘤疾病。从确诊开始，脑胶质瘤患者平均生存 寿命不超过一年。为了治疗这种恶性疾病，必须从分子生物学水平上的深度去探索其发病 机理。最近，有研究报道显示脑胶质瘤中，一些小分子microRNAs (miRNAs)发生了失调，并 影响细胞增殖、凋亡、浸润、转移和血管新生。这些小分子非编码RNA包括miR-21，miR-10b, miR-221/222, miR-26a,和miR-Ma。最近研究发现miR_29a在正常组织中高表达而在神 经母细胞瘤中表达下调。但是关于miRj9a的研究是众说纷纭，有报道说miR-29a在肺癌 和地幔细胞淋巴癌中是下调表现为致癌因子⑶K6的抑制子，而在另外一些报道则显示其 在脊髓白血病和淋巴性白血病中上调而表现为致癌因子。因此，miR-29a在癌症中的是致 癌因子还是抑癌因子有赖于肿瘤的类别和细胞环境，其在脑胶质瘤中的作用也急待进一步 研究清楚。
p53蛋白是一个具有特定序列的转录因子，与肿瘤相关的压力刺激相关。活化的 P53诱导凋亡，抑制异常细胞的的增殖从而抑制肿瘤，而非活化的p53在人类肿瘤中不起作 用。最近已有的一些研究表明，P53可以键合某些特定miRNAs的启动子区来调节它们的转 录。P53活化后可以直接靶向miR-34a，并诱导其在培养细胞中或辐照小鼠体内的表达。除 miR-3^外，一些其他与癌症相关的miRNAs也被证实可以直接靶向p53，包括miR-15/16 和let-7 (靶向致癌因子Bcl2, RAS和HMGA2).相反，p53也可抑制miR-221的表达。
miRNAs通常通过调控它们的特定靶标来实现其功能。已有一些研究表明miR49a 可以靶向胶原蛋白、骨连接素、外围髓鞘蛋白22等，显示出miRj9a在各种疾病中的重要作 用。显然，miRj9a也靶向一些癌症相关的基因B7-H3，CDK6，feis等。发明内容
本发明旨在提供miRNA_29a作为脑胶质瘤临床诊断标志物的应用。
本发明旨在提供miRNA-29a作为制备治疗脑肿瘤药物的应用。
首先在脑胶质瘤组织中检测了 miRj9a的表达情况。同对照组相比，芯片结果和 RNA印迹杂交表明miR-29a在脑胶质瘤中的表达较低(图1A)。为了证实这个，用RNA印迹 杂交技术分析了 6个脑胶质瘤细胞系(SW1783，U138，U251, U87, U373，TJ905)和1个神 经母细胞瘤细胞系(SK-N-SH)。miR-29a在所有的细胞系中都呈显著的下调表达(图1B)。 此外，晚期脑胶质瘤组织的miR-29a原位杂交结果也比正常组要低(图1C)。mil^Ma在脑 胶质瘤中的低表达提示其可能为抑癌基因。
p53在凋亡过程中起着重要作用，提示miRj9a可能同p53有相互关系。采用实时 定量PCR技术检测miR-29a在p53正常细胞株和突变株中的表达情况，发现p53的诱导剂 dexo可以诱导miRj9a的剂量依赖性表达(图2A)。采用蛋白免疫印迹技术观察到Dexo能够诱导脑胶质瘤细胞P53的表达和p53调控基因MDM4，Bcl212和⑶K6的表达(图2B)。过 表达miR-29a可引起脑胶质瘤细胞凋亡(图2C)和降低脑胶质瘤细胞侵袭作用(图2D)。这 些结果表明miRj9a同此前发现的另一个p53调控mil^Ma具有相似的表达模式，因而可 能也受到P53的直接调控。
基于上述结果，考虑如果miRj9a受到p53的直接调控，那么在其转录起始位点的 上游就可能存在以保守且序列一致P53结合位点(图3A)。为了验证预测区域是否具有转 录活性，将P53结合位点的基因组DNA片段及其突变体克隆到荧光素酶报告质粒中，然后在 U87和U251两个细胞系中检测其活性。这个包含p53位点的DNA片段表现出稳定的p53 依赖的转录活性，而P53结合位点突变体则失去了这种活性(图:3B)。进一步使用染色体免 疫共沉淀技术验证了 P53能结合在miR-29a基因启动子区上游的结合位点(图3C)。为了 评估在体内情况下P53是否也可以介导miRj9a的表达，使用了实时定量PCR技术检测经 铯137照射的p53正常小鼠和p53基因敲除小鼠肺中miRj9a的表达。同此前已被证实的 miR-34a的情况一致，可以观察到mirj9a在p53正常小鼠照射后M小时和72小时均显著 高表达，而经铯137照射p53K0小鼠组则无显著变化(图3D)。
观察到miR-29a同p53之间的调控关系，考虑miRj9a是否直接参与了 p53相关基 因的直接调控，如MDM2，MDM4, Bcl212和⑶K6等。靶标预测结果表明，miR_29a在这些基 因内部存在高度保守的作用位点(图4A)。蛋白免疫印迹技术检测表明，在脑胶质瘤细胞系 U87和U251过表达miR-29a均能显著降低MDM4，Bcl212和CDK6蛋白的生成(图4B)。同 时，在脑胶质瘤细胞系U87和U251过表达miR-29a在转染48小时后均出现Gl期细胞数目 比对照组显著增加的现象(图4C)。为了进一步验证miR-29a对这些基因的调控作用，用脑 胶质瘤细胞系U87构建了慢病毒感染的mir-29a稳定表达细胞株。荧光素酶报告实验显示 miR-29a在U87的表达可显著抑制Mdm4，Bcl212和⑶K6报告基因载体的荧光水平，进一 步证实miR-29a可以直接靶向MDM4，Bcl212, CDK6 (图4D)。随后将慢病毒感染的mir_29a 稳定表达U87细胞株慢进行荷瘤实验。15天后发现mirj9aU87细胞的肿瘤大小要明显小 于对照组(图4E)。这些结果提示，miR-29a可在体内显著抑制脑胶质瘤的形成。
基于上述研究结果，本发明研究了 miR_29a在脑胶质瘤早期诊断中的意义。我们 对miR-219在人脑胶质瘤组织样品进行了定量检测。人脑胶质瘤组织样品包括正常组8例， II期6例，III期6例，IV期8例。研究证实miR-29a在脑胶质瘤发展的不同临床时期的 表达水平均显著下调(图5A)。蛋白免疫印迹实验分析表明Mdm4，Bcl212和⑶K6在脑胶质 瘤组织和细胞系中的表达均显著上调(图5B)，进一步证实了三者同miRj9a的相互关系。
本发明首次证实miR-29a在脑胶质瘤中作为肿瘤抑制基因，并通过体外和体内实 验证明其能被P53所调控。在此基础上，不仅进一步证实了 MDM4、BCL2L2等p53应答基因 是其的直接靶标，而且在动物荷瘤实验中证实其可抑制脑胶质瘤的生长。对脑胶质瘤临床 各期标本进行定量研究亦证实miR-29a在脑胶质瘤各时期的表达均显著下调。上述研究结 果提示，通过检定人脑胶质瘤中miRj9a的表达水平或干涉p53信号通路有望为脑胶质瘤 提供一种新的诊断与治疗方案。迄今，尚无miR-29a作为脑胶质瘤一种抑癌基因和一种潜 在生物标志物的文献报道。
图1，miR-29a在脑胶质瘤组织和细胞系中表达下调。
A) miRNA芯片技术检测miR_29a家族的差异表达(左)，RNA印迹杂交技术确认 miR-29a家族的表达。
B) RNA印迹杂交技术分析miR_29a在脑胶质瘤细胞系中的表达。miR_29a在正常 人脑组织中高表达而在脑胶质瘤细胞系中表达相对较低。C1-C7:SW1783，U138，U251, U87, U373, TJ905 and SK-N-SH.C)原位杂交技术分析miR-29a在恶性脑胶质瘤组织及其对照中的表达情况。miRj9a呈显著低表达。
图2，脑胶质瘤miRj9a同p53的表达相关。
A)实时定量PCR技术检测miRNA在脑胶质瘤细胞系中的表达情况。p53诱导剂 Dexo,能够引发miIKMa和miR49a的剂量表达效应。
B)蛋白免疫印迹技术检测p53调控基因在dexo处理脑胶质瘤细胞中的表达。Dexo能 够介导p53的表达，继而MDM4，Bcl212, Bcl211, Bcl2和CDK6的表达。Beta_actin作为对照。
C) Armexin V细胞染色标定检测凋亡。图示右下峰为早期凋亡的细胞，而右上峰 则为晚期凋亡的细胞。在U87和U251细胞系中，miR-29a可以促进细胞的凋亡。
D)脑胶质瘤细胞系U87和U251转染miR-29a及miR_C的脑胶质瘤细胞侵袭实验 (X200)。
图3，p53转录激活mir_29a的表达。
A)人mir-四启动子去的基因组结构。Genbank Acc: EF570049. 预测p53结合 位点(BDS)。p53的结合位点用MAPPER软件预测。
B)p53结合位点及其突变体细胞经过dexo处理后的荧光素酶报告实验。在内源和 外源的P53诱导下就能观察到miR-29a表达的显著升高。
C)p53染色体免疫共沉淀实验。在p53正常株细胞中可以观察到激活的p53结合 在miRj9a的启动子区，而突变株则无。
D)实时定量PCR技术检测正常6周小鼠C57/B ( p53 WT)和p53基因敲除小鼠( P53K0)铯照射后(IOG y)体内miRj9a的表达情况。照射后0，24，72后取组织，所有的操 作都按照动物保护组织的要求。
图4，miR_29a在脑胶质瘤中靶向p53通路基因。
A)图示miRj9a对Mdm4，Bcl212和Cdli6的预测位点及其在不同物种中的保守情 况。首先通过MiRanda vl. Ob (Enright et al. 2003)预测软件针对miR_29a可能作用靶 基因的3’UTR和CDS区域进行搜索，然后在UCSC的基因组窗口浏览器中分析预测位点的保 守型情况(NCBI36/hgl8，http://genome, ucsc. edu/,红色框标示相应预测位点)。
B)蛋白免疫印迹技术检测MDM4，Bcl212和CDK6在U87和U251细胞系中的表达。 MDM4, Bcl212和⑶K6在mir_29a过表达的细胞系中呈显著下调。
C)脑胶质瘤细胞系U87和U251转染miR-29a后的细胞周期分布。在转染48小时 后Gl期细胞数目比对照组显著增加(mean±S. E，n=3)。
D) mir-29a的过表达在慢病毒-mir-29a感染的U87细胞株中可显著抑制MDM4， Bcl212和CDK6报告质粒的荧光表达。(n=3;*p < 0.05)。
E)在体实验证实miR_29a能显著抑制脑胶质瘤细胞的生长。与U87细胞和稳定 表达miRNA阴性对照U87细胞(U87 / mir-scr )相比，能稳定表达mir_29a的U87细 胞株(U87 / mir-29a )在裸鼠的荷瘤实验中生长受到显著抑制。
图5，mir-29a/b在人脑胶质瘤中的表达同恶性程度负相关。
A)实时定量PCR分析mir19a (上)和mir_29b (下)在脑胶质瘤组织中的表达。 正常组织(n=8);II期(n=6);III期(n=6);IV期(n=8)。U6 rRNA作为对照。Cl和C2分别 为淋巴瘤和肺癌脑转移癌症样品。
C)和D)分别为蛋白免疫印迹实验分析p53调控基因在脑胶质瘤组织和细胞系 中的表达情况。结果表明Bcl212，cdli6和mdm4脑胶质瘤组织和细胞系中的表达均显著 上调。都被诱导。N:正常人脑组织；Cl-6: SW1783, U138, U351, U87, U373, SK-N-SH0 Beta-actin作为对照。Marm-Whitney检验被用来比较肿瘤组织及肿瘤细胞与正常组织的 差异。散点图标示miR-29a在三个不同组的表达，横线标示中值。数据分析使用GraphPad prism5软件，p<0. 05具有统计显著性。
具体实施方式
1.动物实验P53基因敲除小鼠购自南京大学模式动物中心，裸鼠(BALB/cA-nu (nu/nu))购自上海 实验动物中心(中科院，中国)，并在标准饮食无病原体条件饲养。
2.脑胶质瘤临床样品采集正常脑组织样品及脑胶质瘤组织样品从复旦大学附属华山医院取得。手术取出后，组 织块以PBS或生理盐水清洗干净，迅速将组织切成小块，部分样品放入2ml冻存管中于液氮 中保存备用。其他用多聚甲醛固定后用于组织切片分析。用于分子分析的样本在液氮中研 磨为粉末后分别提取RNA或蛋白质。
3. RNA 抽提每100 mg组织加入1 mL Trizol，用液氮研磨充分研碎组织块。加入约1/5体积的氯 仿，上下颠倒充分混勻1分钟左右，室温下静置5分钟。4°C，12，000 rpm离心15分钟后小 心转移上清液入新的1. 5ml离心管，加入等体积的异丙醇，轻轻颠倒混勻，室温静置10分 钟。4°C, 12000 rpm离心10分钟后，去上清，向沉淀中加入2/5体积的70%乙醇，4°C，12000 rpm离心洗涤沉淀5分钟。去上清，将沉淀室温晾干后加入适量无RNA酶的水充分溶解，测 定0D260和0D280值。采用无RNA酶的DNA酶I处理，QIAGEN RNeasy试剂盒纯化总RNA， 详细操作原理和方法见试剂盒说明书。琼脂糖胶电泳评价总RNA质量，在凝胶成像仪上观 测、拍照，保存图像，一般认为彡2可以初步判定总RNA质量较好。
4. QR-PCR 检测方法miRNA的qPCR检测使用invitrogen的Trizol抽提总RNA，定量并质检。取50_100ng 总RNA为模板，使用针对特定miRNA的逆转录引物及invitrogen的SuperScript 111 First-Strand Synthesis System试剂盒合成cDNA。以cDNA为模板，使用针对目标miRNA 的 PCR 引物及 Takara 的 SYBR(R) Premix Ex TaqTM 荧光定量 PCR 体系，在 stratagen MX3000P定量PCR仪上进行扩增，并测得样品的Ct值。将所得Ct值通过代入测定标准曲 线得出的公式，采用绝对定量的计算方法得出样品中的目标miRNA的含量。TO基因作为内照对miRNA qPCR检测结果进行标准化校正。对于预测中的目标基因的qPCR检测使用 invitrogen的Trizol抽提总RNA，定量并质检。取3 μ g总RNA为模板，以随机寡核苷酸为 引物，使用 invitrogen 的 SuperScript III First-Strand Synthesis System 试剂盒合 成cDNA。以00嫩为模板，使用针对目标基因的特异引物及1^1 ^￡1的访81 00 Premix Ex TaqTM 荧光定量PCR体系，在stratagen MX3000P定量PCR仪上进行扩增，并测得样品的 Ct值。同时测定待测样品中的看家基因(如β -肌动蛋白、GAPDH)的Ct值，以此来校正各 组样品之间上样量差别，将所得数据标准化后进行比较各组之间目的基因的变化(即相对 定量法)。
5.细胞培养人脑胶质瘤细胞株SW1783、U138、U251、U87、U373和人源神经母细胞株SK-N-SH购自 ATCC (Manassas，VA)，人源胎儿肾细胞株 293Α 购自 Invitrogen (Carlskid, CA) SW1783、 U138、U87、U373和SK-N-SH细胞培养在MEM培养基(Gibco, CA)中，U251细胞培养在 RPIM 1640 培养基(Gibco)中，上述培养基都含有 10% 的 FBS (PAA Laboratories, Linz, Austria)、青霉素(100单位/mL)和链霉素(100 ng/mL)。细胞培养在含有10% FBS,2 mM L-谷氨酰胺、MEM非必需氨基酸溶液(Gibco)和青霉素/链霉素的DMEM培养基中。所 有细胞置37°C培养箱、5%C02，每天传代一次。
6.细胞转染甲氧基寡核苷酸由上海吉玛公司化学合成，microRNA前体购自美国Ambion公司 (Ambion Pre-mir miRNA precursor CaU No. 17100)，转染另设正常对照组，miRNA前体组 和miRNA前体通用阴性对照组。细胞于铺板18-24h后至70%_80%融合开始转染，所用试剂 为Lipofectamine 2000 Gnvitrogen)。转染按本室常规方法并参照说明书进行。细胞于铺 板18-24h后约有70%-80%融合开始转染，所用试剂为Lipofectamine 2000 (Invitrogen). 具体转染方法参照说明书进行，寡核苷酸及siRNA的工作浓度均为lOOnmol/L。
7.体外侵润实验细胞U87分别用miRNA-3k和R-Ras siRNA转染48 h，用寡居核苷酸设阴性对照组。 转染后的细胞(5X IO4个)悬浮于含5% BSA的MEM培养基中，接种于铺有胶原膜的M孔培 养板中，置于培养箱上层培养M h，未吸附的细胞用棉签小心移除。侵入胶原膜下表面的细 胞用细胞染色剂染色，继而计数，最终用微孔板读取器于560 nm处定量测定。
8.流式细胞分析U87细胞和U251细胞以50%密度接种于12孔培养板中培养对h，转染miRNA_29a前体 (100 nM) 3 后收集所得细胞并用70%的乙醇于4°C下固定。所得细胞用Armexin V标定 再进fi"、流式细胞分析(BD FACSaria cell sorter, BD Bioscences, San Jose, CA, USA)。
9. RNA印迹实验RNA样品(25yg)进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(15%)和尿素变性凝胶电泳(8 M)。待前 沿指示剂恰好跑出凝胶后，停止电泳，进行转膜(Amersham Biosciences).将样品转至膜 上后于80°C烘干2 h，进而用互补序列的寡聚核苷酸探针进行杂化处理。该探针为5’-末 端[Y_32P]ATP标记的多聚核苷酸激酶。于39 °C下在ULTRAhyb -寡聚杂化缓冲溶液 (Ambion)中杂化16 h。继而在42°C下用含0. 1% SDS的SSC (2X)洗涤三次。移除寡聚核 苷酸后，于65°C下在1% SDS中重杂化30 min。miRNA探针的序列为mir-21, 5’ -TCAACATCAGTCTGATAAGCTA-3’ ； mir-29a, 5' -TAACCGATTTCAGATGGTGCTA-3‘ mir-124a, 5' -TGGCATTCACCGCGTGCCTTAA-3，。
参照组则用一个互补序列的U6 RNA (5，-GCTAATCTTCTCTGTATCGTTCCAATTTT-3，) 进行杂交。最后在成像系统(scanner Storm 860，Sunnyvale, CA)中读出信号密度，进行 进一步的分析。寡居核苷酸由Biaosime公司合成(上海，中国)。
10.蛋白印迹实验将miRNA-34c( 100 nM)与U87和SK-N-SH细胞、阴性对照细胞接种于12孔培养板中培 养48 h，收集细胞，利用SDS-PAGE凝胶进行蛋白质抽取(25μ g)，所得产物转移至PVDF膜。 多克隆抗体 R-RAS (Cell Signaling Technology, Danvers, MA)和 CCNDl (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)按照使用说明进行稀释并于4° C下培养过夜。接着与 AP-标记的兔抗山羊IgG 二级抗体室温下培养2 h。β-肌动蛋白表达水平用兔源多克隆 抗肌动蛋白抗体进行测定。色带用BCIP/NBT (Ameresco)显色并用Labworks Instrument software (UVP LLC, Upland, CA)进行定量分析。
11.荧光素酶报告实验人源⑶K6、MDM4和BCL2L2基因3，UTR用下列引物进行 PCR扩增CDK6-3UTR-F: 5， - GGTACCTTTCCTACCTATTCTAACG -3，， CDK6-3UTR-R: 5’ - TCTAGAAGGACAGTGATATTTCAAC -3’ ， MDM4-3UTR-F: 5’ - GAATTCGATTTGAGGAGTGGGATG -3’ MDM4-3UTR-R: 5’ - CTCGAGTCAGAACTGTGAGCCAAA -3’。
BCL2L2-3UTR-F: 5’ - GAATTCGTACCCAAACTGAAACTCT -3， BCL2L2-3UTR-R: 5’ - CTCGAGGCAGAAGTCTGGACTCAA -3’。
PCR 扩增产物克隆到 pmd_19t 载体(TaKaRa)，继而克隆到 pGL3_Control vector (Promega)荧光素下游。核苷酸替换突变基于PCR的方法(KOD-Plus-Mutagenesis Kit, T0Y0B0) ο 引物为Mut 3’ UTR of CDK6: 5’ - CAACTTATATCACTGTCCTTCTAGA -3，禾口 5， - ACCAATTTTGAAAAAAACAATGAAC -3，；Mut 3’ UTR of MDM4: 5’ - CCACAAGGAATAAAAGTTGAAGCTGCT -3，禾口 5， - CTAACTGCTCTGATACTGACTCATTC-3，。
Mut 3’ UTR of BCL2L2 5’ - CACAATCTTGTCTGTACCTCAGAGT -3，禾口 5’ - CCATGCAAACAGTGTGGCTTCAA -3’。
上述质粒载体采用Lipofectamine 2000 Qnvitrogen)分别与miRj9a前体共转 染U87细胞，48小时后按Promega提供的方法处理细胞，在多功能酶标仪(BioTek)读取荧 光值。所有实验结果重复三次。
12.慢病毒制备和滴度测定在10厘米的组织培养板，9 μ g的pTRIZP - mir- 29a质粒(Openbiosystems)及包装 W^^ 26ul (Openbiosystems) ^$1 187. 5 Arrest-In transfection reagent (Openbiosystems)感染6 X 106 HEK293T。转染48和72小时后收集含有该病毒培养上 清，用0. 45微米的过滤器filted和病毒储存分装。病毒滴定于转染前一天在M孔组织培养板培养HEK293T细胞(5 X 104)，稀释后的病毒液分别用于感染细胞，感染后48小时后， 统计每毫升RFP表达细胞数，计算病毒滴度。
13.肿瘤在体生长实验六周龄裸鼠(BALB/cA-nu (nu/nu))购自上海实验动物中心(中科院，中国)，并在标准 饮食无病原体条件饲养。小鼠随机分为3组U87细胞组，稳定表达miR -scr U87细胞组 和稳定表达miR -29a U87细胞组。每组细胞(1. 0 X 106， 50ul)分别与50 ul Matrigel 混合注入裸鼠两侧翼皮下，每日观察肿瘤在体生长情况。
14.统计学分析所有数据取平均值t S. Ε.利用Microsoft Excel中的Durmett，s法进行数据分析。 取双尾p<0. 05认为具有统计学意义。
权利要求
1.miRNA-29a化合物作为脑胶质瘤临床诊断标志物的应用。
2.miRNA-29a化合物作为制备治疗脑肿瘤药物的应用。
全文摘要
本发明属生物技术和医学领域，涉及一种人脑胶质瘤新的标志物miR-29a的用途。首次证实了miR-29a在人脑胶质瘤组织和细胞中表达均显著下调，其作为肿瘤抑制基因是其受p53直接调控。同时，也首次证实MDM4、BCL2L2等p53应答基因是其的直接靶标。细胞学实验证明miR-29a能显著抑制脑胶质瘤细胞的增殖和浸润，动物在体实验证实miR-29a可抑制脑胶质瘤的生长。进一步对不同级别的脑胶质瘤临床标本进行定量分析表明miR-29a能作为脑胶质瘤检测的标志物。
文档编号C12Q1/68GK102031308SQ20101056476
公开日2011年4月27日 申请日期2010年11月30日 优先权日2010年11月30日
发明者刘顺英, 张小龙, 李丹, 赖立辉, 赵宇岚, 邹超 申请人:华东师范大学