专利名称：一种agt和ace基因多态性检测特异性引物和液相芯片的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种AGT和ACE基因多态性检测特异性引物和液相芯片。
背景技术：
肾素-血管紧张素-醛固酮(renin-angiotensin system, RAS)是一个激素系统，该系统对血压、血流和内环境调节起着重要的作用，其中，血管紧张素原和血管紧张素转换酶是RAS系统的关键组成部分。血管紧张素原(Angiotensinogen，AGT)是一种主要由肝脏持续合成并释放入血液循环的α-2球蛋白，AGT的主要功能是作为肾素的底物在调节血压上发挥重要作用。血管紧张素转换酶(Angiotensin-Converting Enzyme, ACE)又称二肽羧基肽酶，ACE的主要作用是将血管紧张素I转化为具有强烈缩血管作用的血管紧张素II。在血循环，AGT被肾素水解生成无活性的血管紧张素I (Ang I，10肽)，后者在肺等器官内皮细胞ACE作用下，从Ang I C端切除两个氨基酸生成具有血管收缩活性的8肽，即血管紧张素II (Ang II)。血管紧张素II除具有刺激血管收缩引起血压升高的作用外，还具有促进醛固酮分泌，引起Na+贮留活性。此外ACE还能够催化有促血管舒张作用的缓激肽水解，ACE活性水平的增高刺激了血管平滑肌细胞的增生和细胞外基质的形成，是ACE基因多态性的重要病理生理基石出。人血管紧张素原(AGT)的基因全长131Λ，含5个外显子和4个内含子，位于染色体lq42 43区，AGT的cDNA由1455个核苷酸组成，编码含有485个氨基酸的蛋白质。研究表明，AGT基因中存在某些突变，该突变可引起血浆AGT水平轻度增加，导致Ang I和AngII增加，最终引起血压升高。本发明目标检测的AGT基因突变位点，如表所示
序号AGT位点突变的内容简写1SEQ ID N0. 33的第185位核苷酸，发生T — C突变T185C2SEQ ID N0. 34的第75位核苷酸，发生A — G突变A75G3SEQ ID N0. ；35的第99位核苷酸，发生C — T突变C99T 血管紧张素转换酶编码基因(ACE)位于17号染色体q23位点，长度为211Λ，由沈个外显子和25个内含子组成。其中第16内含子存在一的DNA序列插入(insertion, I)或缺失(deletion，D)，构成 ACE 基因的 I/D 多态性(rsl799752)，因此 ACE基因可分为3中基因型缺失纯合子(DD)型、缺失与插入杂合子(ID)型和插入纯合子(II)型。研究表明，ACE基因I/D多态性与血清及组织中ACE浓度密切相关，ACE的D等位基因数目增多与ACE浓度呈正比。目前研究表明，血管紧张素转换酶基因I/D多态性与心脑血管疾病易感性、严重性及预后显著相关。目前，对AGT和ACE基因多态性进行检测、分析的方法很多，如直接测序法、荧光定量PCR、PCR-RFLP分析法、连接酶检测反应法、等位基因特异性寡核苷酸(ASO)杂交法等等，其中最常用的方法有荧光定量PCR和PCR-RFLP分析法。荧光定量PCR具有操作简便、结果快捷、量化等优点，但是，该技术存在样品易污染，易发生交叉反应，假阳性率高的缺点； 而PCR-RFLP法是基于基因突变造成的限制性内切酶识别位点的改变，如位点丢失或产生新位点，通过PCR扩增某一特定片段，再用限制性内切酶酶切扩增产物，电泳观察片段的大小，这种方法用于检测酶切位点改变的基因突变，可直接判断基因型，但该法不能用于没有产生新酶切位点的基因突变检测。再次，以上这些方法都存在着检测通量的局限性，每次只能检测一种突变类型，不能满足实际应用的需要。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种AGT和ACE基因多态性检测液相芯片，该液相芯片可用于检测AGT基因常见突变位点T185C、A75G和C99T的野生型和突变型，以及ACE基因常见基因型插入/缺失(insertion/deletion，I/D)的野生型和突变型。一种AGT和ACE基因多态性检测液相芯片，包括有(A).针对每种突变分别设计的野生型和突变型的ASPE引物每种ASPE引物由 5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变的特异性引物组成，所述野生型和突变型的特异性引物分别为针对AGT基因的SEQ ID NO. 9及SEQ ID NO. 10,SEQ ID NO. 11及SEQ ID NO. 12、SEQ ID NO. 13 及 SEQ ID NO. 14、和 / 或针对 ACE 基因的 SEQ ID NO. 15 及 SEQ ID NO. 16 ；所述tag序列选自SEQID Ν0· 1 8 ；(B).有anti-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球，所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述anti-tag序列选自SEQ ID N0. 17 SEQ ID N0. 24 中的序列，且所述anti-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对；(C).用于扩增出需要检测的、具有相应突变的目标序列的引物。优选地，所述扩增引物为针对AGT基因T185C突变位点的SEQ ID N0. 25及SEQ IDN0. 26、针对AGT基因A75G突变位点的SEQ ID N0. 27及SEQ ID N0. 28、针对AGT基因 C99T突变位点的SEQ ID N0. 29及SEQ ID N0. 30、和/或针对ACE基因I/D突变的SEQ ID N0. 31 及 SEQ IDN0. 32。优选地，所述ASPE引物为由SEQ ID NO. 1和SEQ ID N0. 9组成的序列及由SEQ ID N0. 2和SEQ ID NO. 10组成的序列、由SEQ ID N0. 3和SEQ ID NO. 11组成的序列及由 SEQ ID N0. 4和SEQ ID N0. 12组成的序列、由SEQ ID N0. 5和SEQ ID N0. 13组成的序列及由 SEQ ID N0. 6 和 SEQ ID N0. 14 组成的序列、和 / 或由 SEQ ID N0. 7 和 SEQ ID N0. 15 组成的序列及由SEQ ID N0. 8和SEQ ID N0. 16组成的序列。优选地，所述间隔臂为5-10个T。本发明的另一目的是提供一种AGT和ACE基因多态性检测的特异性引物。具体技术方案如下一种AGT和ACE基因多态性检测的特异性引物，包括有针对AGT基因的SEQ IDNO. 9 及 SEQ ID NO. 10,SEQ ID NO. 11 及 SEQ ID NO. 12,SEQ ID NO. 13 及 SEQ ID NO. 14、和 / 或针对 ACE 基因的 SEQ ID NO. 15 及 SEQ ID NO. 16。本发明的主要优点在于1.本发明所提供的AGT和ACE基因多态性检测液相芯片的检测结果与测序法的吻合率高达100%，检测所需要的时间远远低于常用的测序技术，特别符合实际应用需要。由于在非常大量的特异性引物中，经过大量试验，反应验证，才能得到最优组合的液相芯片体系，所制备的液相芯片具有非常好的信号-噪声比，并且所设计的探针以及anti-tag序列之间基本上不存在交叉反应，tag标签序列、anti-tag标签序列的选取以及tag标签序列与具体ASPE引物的结合，能够避免交叉反应，实现多个多态性位点的并行检测。2.本发明设计的ASPE引物特异性引物能够灵敏特异地识别目标检测的突变位点，准确区分各种型别的基因型；在同一个反应体系中，不同的特异性引物之间、特异性引物与非目标检测的PCR扩增产物之间基本上不存在交叉反应，检测特异性好，交叉反应率低于3 % ；除了能够单独检测AGT或ACE基因突变情况，也能够同时并行检测AGT基因和ACE 基因多个突变位点的多态性情况，检测效果一致。3.本发明的检测方法步骤简单，可通过一步多重PCR即可完成四条含有多态性位点的目标序列的扩增，避免了反复多次PCR等复杂操作过程中存在的诸多不确定因素，因而可大大提高检测准确率，体现了精确的同时定性、定量分析特征。4.本发明不仅克服了传统固相芯片敏感性不高，检测结果的可重复性差的缺陷， 同时对现有的液相芯片技术进行改进，使得所制备微球能适用于不同的检测项目，具有很强的拓展性。检测的荧光信号值大大提高，从而使得检测的灵敏度进一步得到提高，信噪比增强，检测结果更加准确可靠。
具体实施例方式实施例1 AGT和ACE基因多态性检测液相芯片，主要包括有一、ASPE 引物针对AGT基因常见突变位点T185C、A75G和C99T的野生型和突变型，ACE基因常见基因型插入/缺失(insertion/deletion，I/D)，分别设计特异性引物序列。ASPE引物由 "Tag序列+特异性引物序列”组成。ASPE引物序列如下表所示表1 AGT和ACE基因的ASPE引物序列(Tag序列+特异性引物序列)
权利要求
1.一种AGT和ACE基因多态性检测液相芯片，其特征是，主要包括有(A).针对每种突变分别设计的野生型和突变型的ASPE引物每种ASPE引物由5’端的 tag序列和3’端针对目的基因突变的特异性引物组成，所述野生型和突变型的特异性引物分别为针对 AGT 基因的 SEQ ID NO. 9 及 SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 11 及 SEQ ID NO. 12、 SEQ IDNO. 13 及 SEQ ID NO. 14、和 / 或针对 ACE 基因的 SEQ ID NO. 15 及 SEQ ID NO. 16 ；所述tag序列选自SEQ ID NO. 1 8 ；(B).有anti-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球，所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述anti-tag序列选自SEQ ID NO. 17 SEQ ID NO. M中的序列，且所述anti-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对；(C).用于扩增出需要检测的、具有相应突变的目标序列的引物。
2.根据权利要求1所述的AGT和ACE基因多态性检测液相芯片，其特征是，所述扩增引物为针对AGT基因T185C突变位点的SEQ ID NO. 25及SEQ ID NO. 26、针对AGT基因A75G 突变位点的SEQ ID NO. 27及SEQ ID NO. 28、针对AGT基因C99T突变位点的SEQ ID NO. 29 及 SEQ IDN0. 30、和 / 或针对 ACE 基因的 SEQ ID NO. 31 及 SEQ ID NO. 32。
3.根据权利要求1所述的AGT和ACE基因多态性检测液相芯片，其特征是，所述ASPE引物为由SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 9组成的序列及由SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 10组成的序列、由SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 11组成的序列及由SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 12组成的序列、由SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 13组成的序列及由SEQ ID NO. 6和SEQ ID NO. 14 组成的序列、和/或由SEQ ID NO. 7和SEQ ID NO. 15组成的序列及由SEQ ID NO. 8和SEQ ID NO. 16组成的序列。
4.根据权利要求1所述的AGT和ACE基因多态性检测液相芯片，其特征是，主要包括有⑷·所述ASPE引物由SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 9组成的序列及由SEQ ID NO. 2和 SEQ ID NO. 10组成的序列、由SEQ ID N0. 3和SEQ ID NO. 11组成的序列及由SEQ ID N0. 4 和SEQ ID N0. 12组成的序列、由SEQ ID N0. 5和SEQ ID N0. 13组成的序列及由SEQ ID N0. 6和SEQ ID N0. 14组成的序列、和由SEQ ID N0. 7和SEQ ID N0. 15组成的序列及由SEQ ID N0. 8和SEQ ID N0. 16组成的序列；(B).有anti-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球，所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述anti-tag序列选自SEQ ID N0. 17 SEQ ID NO. M中的序列，且所述anti-tag序列能相应地与㈧中所选的tag序列互补配对；(C).扩增引物针对AGT基因T185C突变位点的SEQID N0. 25及SEQ ID N0.沈、针对AGT基因A75G突变位点的SEQ ID N0. 27及SEQ ID N0.沘、针对AGT基因C99T突变位点的 SEQ IDN0.四及 SEQ ID N0. 30、和针对 ACE 基因 I/D 突变的 SEQ ID N0. 31 及 SEQ ID N0. 32。
5.根据权利要求1-4任一项所述的AGT和ACE基因多态性检测液相芯片，其特征是，所述间隔臂为5-10个T。
6.一种AGT和ACE基因多态性检测的特异性引物，其特征是，包括有针对AGT基因的 SEQ IDN0. 9 及 SEQ ID N0. 10,SEQ ID NO. 11及 SEQ ID NO. 12,SEQ ID NO. 13 及 SEQ ID NO. 14、和 / 或针对 ACE 基因的 SEQ ID NO. 15 及 SEQ ID NO. 16。
全文摘要
本发明公开了一种AGT和ACE基因多态性检测特异性引物和液相芯片，所述液相芯片主要包括有由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变的特异性引物组成的ASPE引物，所述特异性引物分别为针对AGT基因的SEQ ID NO.9及SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11及SEQ IDNO.12、SEQ ID NO.13及SEQ ID NO.14、和/或针对ACE基因的SEQ ID NO.15及SEQ ID NO.16；由anti-tag序列包被的微球；扩增引物。本发明所提供的AGT和ACE基因多态性检测液相芯片的检测结果与测序法的吻合率高达100％。所制备的液相芯片具有非常好的信号-噪声比，并能够避免交叉反应，实现多个多态性位点的并行检测。
文档编号C12Q1/68GK102559852SQ201010591008
公开日2012年7月11日 申请日期2010年12月16日 优先权日2010年12月16日
发明者刘志明, 秦会娟, 许嘉森, 郭婧 申请人:广州益善生物技术有限公司