专利名称：一种铜绿假单胞菌菌株及其应用的制作方法
一种铜绿假单胞菌菌株及其应用
技术领域：
本发明涉及一种微生物及其应用，尤其涉及一种铜绿假单胞菌菌株FJAT-346及应用其制备防治香蕉枯萎病的发酵液。
背景技术：
香蕉枯萎病是由尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporumf. sp. Cubense)引起的维管束坏死的系统性土传病害，是香蕉上的重要病害，严重威胁着世界香蕉种植业。由于该菌能在土壤中存活多年且在香蕉的整个生育期均可侵染，同时还存在多个专化型，因此香蕉枯萎病的防治存在很大的难度。目前，尚无有效的抗病香蕉品种，而且现有的化学药剂在防治上也难以奏效。采用生物防治，特别是内生生防菌是当前比较有效的途径之一。国内外在利用生防菌防治香蕉枯萎病方面已有一些报道。Thangavelu等从香蕉根际土壤中分离到1株哈茨木霉，通过离体与田间试验均测得该菌对香蕉枯萎病的防效优于多菌灵。 Idris等通过温室试验得到4株对尖孢镰刀菌有强烈抑制作用的杆菌属细菌；Saravanan等比较了荧光假单胞菌等8种生防菌在离体、盆栽和大田条件下对香蕉枯萎病的防效，发现荧光假单胞菌的抑菌作用最好。国内对香蕉枯萎病生物防治的研究刚刚起步，大多还处在对香蕉枯萎病的拮抗菌筛选阶段。铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)在植物病害防治方面，国内外也有一些报道，其一方面可作为植物促长剂，增强植株抗病性；另一方面可作为生防菌剂，防治植物病害。Viji等通过盆栽和大田试验，发现预先施用铜绿假单胞菌能很好地防治黑麦草灰斑病；Dutta等研究发现铜绿假单胞菌能诱导木豆系统抗病性，预防镰刀菌的侵染；Siddiqui 和Shaukat研究表明，用铜绿假单胞菌处理土壤，能显著减少根结线虫的数量，同时能促进番茄植株生长。值得一提的是，以往绝大多数植物病害生防菌是从土壤或植物根际土壤微生物中分离筛选得到的，但由于这些土壤微生物易受外界条件的影响，并难于在与土壤、植物根际或叶围习居微生物的竞争中长期占优势，因而极大地影响了其实用价值，植物内生细菌作为生防因子有很多优点它们分布于植物的不同组织中，有充足的营养物质，同时受到植物组织的保护，不受外部恶劣环境如强烈日光、紫外线、风雨等的影响，具有稳定的生态环境。 因此，内生细菌相对于附生细菌更易于发挥生防作用。另外，利用香蕉内生的铜绿假单胞菌防治香蕉枯萎病，国内外尚未见报道与利用。
发明内容本发明所要解决的技术问题在于提供一种铜绿假单胞菌菌株 FJAT-346 (Pseudomonas aeruginosa FJAT-346)，该铜绿假单胞菌菌株 FJAT-346 于 2010 年 11月1日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址为武汉市珞珈山武汉大学，保藏编号为CCTCC NO =M 2010286，且采用该菌株制备一种能够对香蕉枯萎病进行有效防治的发酵液。
本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的本实验室从福建省漳州市的香蕉植株的内生细菌中分离并筛选得到一种具有拮抗作用的菌株，且对该菌株的理化特性和16S rDNA序列(如图1所示)进行测定分析，最终鉴定其为铜绿 假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的一个菌株。进一步地，采用该菌株制备一种能够防治香蕉枯萎病的发酵液，其制备的具体步骤为(1)铜绿假单胞菌FJAT-346的活化用接种环将铜绿假单胞菌菌株FJAT-346划线接种于菌株培养基上，并于恒温培养箱中培养24h，且培养温度设定为室温；(2)种子液的制备将步骤(1)所获得的铜绿假单胞菌菌株FJAT-346的单菌落接种于三角瓶的种子培养基中，并将三角瓶置于恒温摇床振荡培养，转速200rpm，温度设定为室温，培养2天后即得种子液；(3)发酵液的制备将步骤(2)所获得的铜绿假单胞菌菌株FJAT-346的种子液接种到含已灭菌发酵培养基的发酵罐中，接种量1%，搅拌速率180rpm，通气量1 1.2，温度设定为室温；在发酵培养的过程中每隔一段时间取适量的发酵液测定其菌体浓度，当测定的菌体浓度值大于1.0X 108CFU/mL时，则获得所需的发酵液。进一步地，所述步骤(1)中所述菌株培养基为NA培养基，其组分为牛肉浸膏 0. 1%，蛋白胨0.5%，酵母膏0.5%，氯化钠0.5%，蔗糖1%，琼脂1.8%，以水配制，pH 6. 8-7. 0 ；种子培养基与发酵培养基均为NB培养基，其组分均为牛肉浸膏0. 1%，蛋白胨 0. 5%，酵母膏0. 5%，氯化钠0. 5%，蔗糖1%，以水配制，pH 6. 8-7. 0 ；且各培养基组分中的百分比均为重量比。本发明的有益效果在于提供一种铜绿假单胞菌菌株FJAT-346 (Pseudomonas aeruginosa FJAT-346)，并且采用该铜绿假单胞菌菌株FJAT-346制备能够对香蕉枯萎病起到防治作用的发酵液，该发酵液对引起香蕉枯萎病的尖孢镰刀菌具有很强的抑制作用。
下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的描述。图1是本发明一种铜绿假单胞菌菌株FJAT-346的16S rDNA序列。
具体实施方式本发明一种铜绿假单胞菌菌株(Pseudomonas aeruginosa)FJAT-346是从福建漳州一块香蕉枯萎病发生严重的田块所种植的香蕉植株体内的内生细菌中分离并筛选得到具有生物防治作用的菌株，该菌株能定殖于寄主体内，并伴随植物的生长而繁殖，通过营养竞争、位点竞争及免疫抗病机制，能达到长期阻碍病原菌的侵入、延缓及抑制病害发生的目的；并且采用该铜绿假单胞菌菌株FJAT-346制备能够对香蕉枯萎病起到防治作用的发酵液，该发酵液对引起香蕉枯萎病的尖孢镰刀菌具有很强的抑制作用。1.菌株的分离(1)在福建漳州香蕉枯萎病发生田块中随机采集果实成熟期的香蕉植株，具体为罹患枯萎病植株和健康植株各5株，并对各植株不同部位进行选取，且各部位选取依据如下根部选取距土表30cm左右的材料；茎部分别选取根茎交接处IOcm以内、中段IOcm以内、距顶端IOcm以内的部分；地下球茎、叶柄、叶片随机选取；(2)在超净工作台内取步骤(1)所获得的各部位香蕉植株的组织为样品，接着用 1. 0%次氯酸钠溶液将其浸泡5min，然后用无菌水反复漂洗，漂洗结束后利用无菌滤纸将水分吸干，再将样品表面与培养皿接触3 5min，同时取最后一次漂洗所用的无菌水将样品涂布于培养皿上，接着把培养皿放在30°C的恒温箱中培养，若培养过程中无菌落出现，则说明样品表面灭菌彻底，否则需要重新进行操作；(3)用无菌剪刀将步骤(2)所得的表面以彻底灭菌的样品剪碎在无菌研钵中，并加入9mL无菌水充分研磨至勻浆，接着将该勻浆以10_2、10_3、10_4、10_5梯度分别进行稀释， 然后取每个稀释液均取200 μ 1涂布于NA平板上，且每个梯度设3个重复，之后将NA平板置于30°C恒温条件下培养1-2天至长出单菌落，再根据菌落颜色、形状、干湿、高度、透明度、边缘等特征，挑取各部位具有代表性的单菌落作为待测菌，并将待测菌保存于NA斜面备用；(4)以尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f. sp. Cubense)为靶标菌，采用平板对峙培养法和平板扩散法筛选有拮抗作用的生防菌，并选取对尖孢镰刀菌具有最强抑制作用的菌株，标记为FJAT-346。2.菌株的鉴定 将所获得的对尖孢镰刀菌具有最强抑制作用的菌株进行理化及生物学特性的测定，结果如下菌体杆状，菌落圆形、扁平隆起、光滑湿润，培养初期琼脂被染成黄绿色、后期转为褐色，革兰氏染色阴性，具鞭毛，无芽孢，需氧，可在41°C下生长，淀粉水解反应阴性，明胶液化反应阳性，精氨酸双水解酶反应阳性，反消化反应阳性。将上述理化及生物学特性结合该菌株的16S rDNA序列(如图1所示)进行分析比对，可判定该菌株为铜绿假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa)03. 一种能够防治香蕉枯萎病的发酵液的具体制备步骤为(1)铜绿假单胞菌FJAT-346的活化用接种环将铜绿假单胞菌菌株FJAT-346划线于菌株培养基上，并于恒温培养箱中培养24h，且培养温度设定为室温；(2)种子液的制备将步骤(1)所获得的铜绿假单胞菌菌株FJAT-346的单菌落接种于三角瓶的种子培养基中，并将三角瓶置于恒温摇床振荡培养，转速200rpm，温度设定为室温，培养2天后即得种子液；(3)发酵液的制备将步骤(2)所获得的铜绿假单胞菌菌株FJAT-346的种子液接种到含已灭菌发酵培养基的发酵罐中，接种量1%，搅拌速率180rpm，通气量1 1.2，温度设定为室温；在发酵培养的过程中每隔一段时间取适量的发酵液测定其菌体浓度，当测定的菌体浓度值大于1.0X 108CFU/mL时，则获得所需的发酵液。其中，步骤(1)中所述菌株培养基为NA培养基，其组分为牛肉浸膏0.1%，蛋白胨0. 5 %，酵母膏0.5%，氯化钠0. 5 %，蔗糖1 %，琼脂1. 8 %，以水配制，pH 6. 8-7. 0 ；种子培养基与发酵培养基均为NB培养基，其组分均为牛肉浸膏0. 1 %，蛋白胨0. 5 %，酵母膏 0.5%，氯化钠0.5%，蔗糖1%，以水配制，pH 6.8-7.0 ；且各培养基组分中的百分比均为重量比。4.铜绿假单胞菌菌株FJAT-346发酵液的抑菌活性测试同时设置实验组和对照组，在实验组中，取孢子浓度为107CFU/mL的香蕉枯萎病病原菌悬浮液lmL，并将其加入到温度降至约50°C熔融态的PDA培养基内，迅速混勻后将培养基进行倒平板，待培养基凝固后在平板中间打直径6mm孔，在该孔内注入50 μ L浓度为 107CFU/mL菌株FJAT-346的发酵液；以在孔内注入无菌水为对照组；实验组和对照组菌重复3次，且分别于30°C条件下培养5天后测各抑菌圈的直径。 结果显示实验组产生明显的透明抑菌圈，抑菌圈平均直径为29mm，而对照组为 Omm,表明所制备的铜绿假单胞菌菌株FJAT-346发酵液对香蕉枯萎病病原菌有极强的抑菌能力(一般认为生防菌拮抗病原菌的抑菌圈> IOmm即可称为有较强抑菌能力)。5.铜绿假单胞菌菌株FJAT-346的发酵液对香蕉枯萎病的防治试验(1)铜绿假单胞菌菌株FJAT-346的发酵液对香蕉枯萎病的盆栽防治试验采用伤根接种法接种，且以浓度为107CFU/mL的铜绿假单胞菌菌株FJAT-346发酵液为接种的生防菌，香蕉枯萎病病原菌的接种浓度为105CFU/mL，试验设5个处理组，分别为a.只接种生防菌；b.先接种生防菌，3 天后接种病原菌；c.先接种病原菌，3天后接种生防菌；d.同时接种生防菌和病原菌；e.清水对照。其中每30株香蕉盆栽苗为一处理组，且各处理组中的接种量均为50mL/株，并在接菌30天后调查病情指数。病情指数=Σ (病级株数X代表级数)/(植株总数X最高代表级值)X 100%。(2)铜绿假单胞菌菌株FJAT-346的发酵液对香蕉枯萎病的田间防治试验田间防治试验选在福建省农业科学院甘蔗研究所的试验基地进行，并采用伤根接种法接种，设置实验组和对照组，每组50株大田香蕉苗，实验组接种浓度为107CFU/mL的铜绿假单胞菌菌株FJAT-346发酵液，接种量为50mL/株，且以清水为对照组。接菌240天后调查实验组和对照组的发病率，并计算防治效果。防治效果(％ )=(对照发病率_处理发病率)/对照发病率X 100%盆栽防治试验的结果显示，接种铜绿假单胞菌菌株FJAT-346发酵液和香蕉枯萎病病原菌30天后，处理组b、处理c和处理d的病情指数分别是11. 43、40. 00和24. 29，未使用发酵液防治的处理组e病情指数为69. 99，且处理组b、处理c和处理d对香蕉枯萎病的防治效果分别为83. 67%,42. 86%和65. 83%，说明FJAT-346的发酵液对香蕉枯萎病有较好的预防作用；处理组a与处理组e相比，未见香蕉植株异常，表明本生防菌(即铜绿假单胞菌菌株FJAT-346发酵液)不会对香蕉植株的生长产生副作用。田间防效测定结果显示，实验组和对照组的香蕉枯萎病发病率分别是4%和 22 %，且铜绿假单胞菌菌株FJAT-346发酵液对香蕉枯萎病的田间防治效果为82 %。6.铜绿假单胞菌菌株FJAT-346的毒性检测实验为确保铜绿假单胞菌菌株FJAT-346对人、动物和环境无害，特委托福建省疾病预防控制中心对FJAT-346进行毒性检测。 取原样(浓度为106CFU/ml的铜绿假单胞菌菌株FJAT-346发酵液)25g加蒸馏水至50ml作为受试物，且需在临用前配制；靶标动物是选用上海斯莱克实验动物有限责任公司提供的清洁级SD大鼠20只，体重为186-217g，雌雄各半(许可证号 SCXK(沪)2007-0005)。试验方法动物观察饲养一周后，试验前大鼠隔夜禁食16h，但不禁水，然后采用灌胃方式，按10ml/kg体重给予受试物，经口一次灌胃，染毒剂量为5000mg/kg 体重(其中受试物是指送检的铜绿假单胞菌菌株FJAT-346发酵液，染毒剂是指该发酵液中的有效成分)，连续观察14d，观察并记录动物中毒的表现和死亡情况。试验结束后，处死存活动物，进行解剖检查。检测结果报告编号“闽疾控中心卫检农09-0004”，结果表明(如表1所示)，试验期间动物生长良好，未见明显异常，无动物死亡。试验结束后，解剖处死的存活动物，尸检未见异常。该样品急性毒性试验结果为LD5tl > 5000mg/kgBff,根据急性毒性分级属低毒，对人、 动物和环境无害，可在田间大规模应用。表1铜绿假单胞菌菌株FJAT-346对大鼠的急性经口毒性试验
权利要求
1.一种铜绿假单胞菌菌株，其特征在于所述菌株为铜绿假单胞菌菌株 FJAT-346 (Pseudomonas aeruginosa FJAT-346)，于 2010 年 11 月 1 日保藏于位于武汉市洛珈山武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO :M 2010286。
2.一种防治香蕉枯萎病的发酵液，其特征在于其制备方法的具体步骤为(1)铜绿假单胞菌FJAT-346的活化用接种环将铜绿假单胞菌菌株FJAT-346划线接种于菌株培养基上，并于恒温培养箱中培养24h，且培养温度设定为室温；(2)种子液的制备将步骤(1)所获得的铜绿假单胞菌菌株FJAT-346的单菌落接种于三角瓶的种子培养基中，并将三角瓶置于恒温摇床振荡培养，转速200rpm，温度设定为室温，培养2天后即得种子液；(3)发酵液的制备将步骤(2)所获得的铜绿假单胞菌菌株FJAT-346的种子液接种到含已灭菌发酵培养基的发酵罐中，接种量1%，搅拌速率180rpm，通气量1 1.2，温度设定为室温；在发酵培养的过程中每隔一段时间取适量的发酵液测定其菌体浓度，当测定的菌体浓度值大于1. OX 108CFU/mL时，则获得所需的发酵液。
3.如权利要求2所述一种防治香蕉枯萎病的发酵液，其特征在于所述步骤(1)中所述菌株培养基为NA培养基，其组分为牛肉浸膏0. 1 %，蛋白胨0. 5 %，酵母膏0. 5 %，氯化钠0. 5%，蔗糖1%，琼脂1. 8%，以水配制，pH 6. 8-7. 0 ；种子培养基与发酵培养基均为 NB培养基，其组分均为牛肉浸膏0. 1 %，蛋白胨0. 5 %，酵母膏0.5%，氯化钠0. 5 %，蔗糖 1%，以水配制，pH 6. 8-7. 0 ；且各培养基组分中的百分比均为重量比。
全文摘要
本发明一种铜绿假单胞菌菌株(Pseudomonas aeruginosa)FJAT-346是从福建漳州一块香蕉枯萎病发生严重的田块所种植的香蕉植株体内的内生细菌中分离并筛选得到具有生物防治作用的菌株，该菌株为铜绿假单胞菌菌株(Pseudomonas aeruginosa)FJAT-346，并用该菌株制备获得一种能够防治香蕉枯萎病的发酵液。本发明的优点在于提供了一种分离自香蕉植物体内的内生生防菌铜绿假单胞菌菌株FJAT-346，并且采用该菌株制备获得的能够防治香蕉枯萎病的发酵液，对香蕉枯萎病菌具有较佳的抑制作用，发酵液制备工艺简单，更重要的是完全无毒害，具有很好的生产应用前景。
文档编号C12N1/20GK102168042SQ20101060048
公开日2011年8月31日 申请日期2010年12月22日 优先权日2010年12月22日 公开号201010600487.9
发明者刘波, 唐建阳, 朱育菁, 肖荣凤, 葛慈斌 申请人:福建省农业科学院农业生物资源研究所