专利名称：丝状真菌启动子、终止子和包含它们的质粒的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种丝状真菌启动子、终止子和包含它们的质粒。
背景技术：
稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)是一种研究植物病原真菌-寄主植物相互作用的丝状真菌模式生物，具有许多病原真菌共有的植物致病侵染循环，包括孢子产生、萌发、 附着胞形成、侵染栓形成、侵入菌丝生长等致病过程。由稻瘟病菌引起的稻瘟病是世界性的一种水稻上的毁灭性病害。世界上每年由稻瘟病造成的水稻产量损失在10 30%之间； 我国几乎每年都有稻瘟病菌的流行爆发。许多发达国家正在进行研究其致病分子机制，期望通过此类研究开发具有抗瘟特征的水稻品种，以及开发、设计新型抗真菌药物。稻瘟病菌的致病过程是一个复杂的分子过程。目前已经克隆了许多与稻瘟病菌致病性相关的基因，如MPG1、CPKA, PMKU MAGB, PLSl、SMOl、PDEl、MPSl、PTHll、CBPl、ICLl、 BUFl、ALBl、ACRl、RSYl、HEXl、ATGs, MNH6 等(Nguyen et al.，2008 ；Egan et al.，2007 ； Veneault-Fourrey et al. , 2006 ；Dean,2005 ；Soundararajan et al. , 2004 ；Talbot,2003 ； Talbot, 1999 ；Choi and Dean, 1997 ；Mitchell & Hamer，1995 等)。尽管如此，稻癌病菌的分子致病机制还是不很清楚，绝大多数的基因功能还未知。鉴定、克隆植物病原真菌的致病性基因，尤其是与侵入过程相关的基因，可以为开发具有抗瘟特征的水稻品种，以及设计、筛选抗真菌药物提供有用的参考。目前根据稻瘟病菌无毒基因和水稻抗病基因的互作关系，选育了很多水稻抗瘟品种；也已经在包括稻瘟病菌在内的一些真菌中证明了一些药物的靶点，如三环唑是一种很重要的稻瘟病菌杀菌剂， 其作用是抑制黑色素的合成，靶点是稻瘟病菌的三羟萘还原酶；多肽杀菌剂sorphenA的作用靶点是青霉的脱甲基酶(CYP51)。鉴定、克隆植物病原真菌的致病性基因，需要分析蛋白在细胞内的定位、蛋白过量表达对植物病原真菌的作用等，这都需要一种丝状真菌细胞内蛋白快速表达和高效表达的系统。目前，每个基因研究还都需要各自建立一个基因表达系统(如NAR启动子；RP27启动子)，缺少高效的、通用的丝状真菌蛋白表达系统。
发明内容
本发明提供了一种丝状真菌启动子，利用该启动子可以在丝状真菌菌丝、分生孢子、附着孢等各个阶段高丰度表达蛋白、RNA或DNA。一种丝状真菌启动子(或者互补链)，具有SEQ ID N0.1所示的碱基序列。一种丝状真菌终止子(或者互补链)，具有SEQ ID N0. 2所示的碱基序列。本发明提供了包含上述启动子和/或终止子的质粒。该质粒可以是原始表达载体，该原始表达载体含有抗性基因SUR或抗性基因ΝΕ0， 也可以是重组表达载体；也可以是重组表达载体，其外源基因为GFP蛋白基因或红色荧光蛋白基因。本发明提供了上述质粒在丝状真菌中表达蛋白、DNA或RNA中应用。本发明提供了包含上述质粒的转化子。本发明启动子是一个强启动子，在稻瘟病菌的菌丝、孢子和附着胞阶段都高强度启动。该启动子基因属于表达强度在稻瘟病菌细胞内稳定性在前100位以内的基因。该基因是一个清除细胞内活性氧的重要基因，对于维持细胞的正常运转具有重要作用。该基因在活性氧诱导下可以大量诱导表达，用于合成大量的重组蛋白。
图1是pKD6表达载体的构建过程示意图。pKD6质粒具有卡那霉素(Kana)抗性和磺胺嘧啶(SUR)抗性筛选标记。图2是pKD6-GFP表达载体的构建过程示意图。pKD6_GFP质粒具有卡那霉素 (Kana)抗性和磺胺嘧啶(SUR)抗性筛选标记，含有eGFP绿色荧光基因。图3是pKD6-DsRED表达载体的构建过程示意图。pKD6_DsRED质粒具有卡那霉素 (Kana)抗性和磺胺嘧啶(SUR)抗性筛选标记，含有DsRED红色荧光基因。图4是PKD8表达载体的构建过程示意图。pKD8质粒具有卡那霉素(Kana)抗性和新霉素(Neo)抗性筛选标记。图5是pKD8-GFP表达载体的构建过程示意图。pKD8_GFP质粒具有卡那霉素 (Kana)抗性和新霉素(Neo)抗性筛选标记，含有eGFP绿色荧光基因。图6是pKD8-DsRED表达载体的构建过程示意图。pKD8_DsRED质粒具有卡那霉素 (Kana)抗性和新霉素(Neo)抗性筛选标记，含有DsRED红色荧光基因。图7是SODl启动子驱动的DsRED荧光蛋白在稻瘟病菌菌丝和孢子强烈表达。左方(A)为暗视场下拍摄，右方(B)为明视场下拍摄；红色为DsRED发出的红色荧光。图8是SODl启动子驱动的GAPDH-GFP融合蛋白在菌丝细胞中的定位。GAPDH-GFP 融合蛋白发出的绿色荧光分布于细胞质中；上方(A)为暗视场下拍摄，下方(B)为明视场下拍摄。
具体实施例方式实施例1获得稻瘟病菌SODl启动子序列。从稻瘟病菌Guyll菌株(Fungal Genetics Stock Center)的菌丝体中提取DNA 并作为模板，根据稻瘟病菌70-15菌株的基因组数据库设计引物，利用高保真PCR方法扩增 SODl基因的启动子序列。上游引物al :5，-ATgaattcCGGTCATAACGCCAAGTTAATA-3，；下游引物a2 5，-ATTCTAGACCCGGGGGATCCGACCATTTTGACGGTTGTTTGGTA-3，。在上游引物中引入EcoRI位点；在下游引物中引入BamHI-SmaI-XkiI位点。PCR体系为稻瘟病菌基因组DNA 1 μ 1，高保真DNA聚合酶0. 5 μ 1， dNTP(50mM)0. 4μ 1，上下游引物各 0. 5μ l，10x PCR 缓冲液 5 μ 1，加水至 50 μ 1。PCR运行条件为94°C 3分钟，35个循环(94°C 30秒，58°C 1分钟，72°C 1分钟30 #), 720C 10 分钟。
PCR产物经琼脂糖电泳，切下1. 5kb大小的目的条带，经胶回收纯化，连接到 PGEM-T EASY载体上，转化大肠杆菌感受态细胞DH5 α，挑取胺苄平板上长出的菌落进行培养，提取质粒、酶切鉴定，然后测序证实。经测序证实SODl启动子的DNA编码序列为SEQ ID NO. 1所示。实施例2获得稻瘟病菌RP27终止子序列的从稻瘟病菌Guyll菌株的菌丝体中提取DNA并作为模板，根据稻瘟病菌70_15菌株的基因组数据库设计引物，利用高保真PCR方法扩增RP27基因的终止子序列。上游引物bl :5，-ATCTGCAGTAAGCGACACGCCATCACGATA-3，；下游弓丨物b2 5，-ATAAGCTTTGTTGAAATTACCAGCGATTCGA-3，。在上游引物中引入I3StI位点；在下游引物中引入HindIII位点。PCR体系为稻瘟病菌基因组DNA为1 μ 1，高保真DNA聚合酶0.5 μ 1，dNTP (50mM) 0. 4 μ 1，上下游引物各 0. 5μ Ι,ΙΟχ PCR 缓冲液 5 μ 1，加水至 50 μ 1。PCR运行条件为94°C 3分钟，；35个循环(94°C 30秒，60°C 1分钟，72°C 30秒)， 72 V 10分钟。PCR产物经琼脂糖电泳，切下1. 5kb大小的目的条带，经胶回收纯化，连接到 PGEM-T EASY载体上，转化大肠杆菌感受态细胞DH5 α，挑取胺苄平板上长出的菌落进行培养，提取质粒、酶切鉴定，然后测序证实。经测序证实RP27终止子的DNA编码序列为SEQ ID NO. 2所示。实施例3构建携带SODl启动子和RP27终止子的重组表达载体重组表达载体pKD6的构建利用抗性基因SUR的PCR引物从pCB15^经PCR获得 SUR基因片段。上游引物c 1 5，-GTGCCAACGCCACAGTGCC-3，下游引物c2 5，-GCGAATTCACTAGTGATTGTGAATCGTGAGAGCATGCAATTCCC-3，克隆到pGEM-T EASY载体，转化大肠杆菌感受态细胞DH5 α，挑取胺苄平板上长出的菌落进行培养，提取质粒、酶切鉴定。重组载体然后用》ιοΙ和EcoRI酶切，2. Skb的酶切片段(SUR基因片段)插入pCAMBIA1300载体的BioI和EcoRI位点；重组载体转化大肠杆菌感受态细胞DH5 α，挑取胺苄平板上长出的菌落进行培养，提取质粒、酶切鉴定。鉴定正确的载体再用I3StI和HinDIII双酶切后，与RP27终止子相连；重组载体转化大肠杆菌感受态细胞DH5 α，挑取胺苄平板上长出的菌落进行培养，提取质粒、酶切鉴定。验证连接RP27终止子正确的载体用EcoRI和MlI酶切后，再与SODl启动子相连；重组载体转化大肠杆菌感受态细胞DH5 α，挑取胺苄平板上长出的菌落进行培养，提取质粒、酶切鉴定。将获得的验证正确的载体命名为pKD6(如附图1所示)。(I)GFP蛋白重组表达载体pKD6-GFP的构建过程利用GFP的PCR引物从pGFP经PCR获得GFP基因片段，上游引物dl:5 ‘-AAcccgggATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3，下游引物d2 5 ‘ -AATCTAGACTTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3，，克隆到pGEM-T EASY载体，转化大肠杆菌感受态细胞DH5 α，挑取胺苄平板上长出的菌落进行培养，提取质粒、酶切鉴定。重组载体然后用Small和^CbaI酶切，GFP基因片段插入表达载体PKD6的Small和)(baI位点；转化大肠杆菌感受态细胞DH5 α，挑取胺苄平板上长出的菌落进行培养，提取质粒、酶切鉴定。将获得的验证正确的载体命名为PKD6-GFP (如附图2所示)。(2)红色荧光蛋白重组表达载体pKD6_DsRED的构建过程利用DsRED的PCR引物，从pDsRED2经PCR获得DsRED基因片段，上游引物el :5 ‘-AAcccgggATGGCCTCCTCCGAGAACGTCATC-3，下游引物e2 5 ‘ -AATCTAGACAGGAACAGGTGGTGGCG-3，。克隆到pGEM-T EASY载体，转化大肠杆菌感受态细胞DH5 α，挑取胺苄平板上长出的菌落进行培养，提取质粒、酶切鉴定。重组载体然后用Small和^CbaI酶切，DsRED基因片段插入表达载体PKD6的Small和)(baI位点；转化大肠杆菌感受态细胞DH5 α，挑取胺苄平板上长出的菌落进行培养，提取质粒、酶切鉴定。将获得的验证正确的载体命名为 pKD6-RED(如附图3所示)。(3)重组表达载体pKD8的构建过程利用抗性基因NEO的PCR引物，从pSilent-DualIPCR扩增获得NEO基因片段，上游引物fl :5，-GCactagtGAGGTCAACACATCAATGC-3，下游引物f2 :5，-TTctcgagTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCG-3’,克隆到pGEM-T EASY载体，转化大肠杆菌感受态细胞DH5 α，挑取胺苄平板上长出的菌落进行培养，提取质粒、酶切鉴定。重组载体然后用》ιοΙ和EcoRI酶切，1. Ikb的酶切片段(ΝΕΟ基因片段)插入pCAMBIA1300载体的BioI和EcoRI位点；重组载体转化大肠杆菌感受态细胞DH5 α，挑取胺苄平板上长出的菌落进行培养，提取质粒、酶切鉴定。鉴定正确的载体再用I3StI和HinDIII双酶切后，与RP27终止子相连；重组载体转化大肠杆菌感受态细胞DH5 α，挑取胺苄平板上长出的菌落进行培养，提取质粒、酶切鉴定。验证连接RP27终止子正确的载体用EcoRI和MlI酶切后，再与SODl启动子相连；重组载体转化大肠杆菌感受态细胞DH5 α，挑取胺苄平板上长出的菌落进行培养，提取质粒、酶切鉴定。将获得的验证正确的载体命名为PKD8 (如附图4所示)。(4) GFP蛋白重组表达载体pKD8-GFP的构建过程利用GFP的PCR引物从pGFP经PCR获得GFP基因片段，上游引物gl:5 ‘-AAcccgggATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3，下游引物g2 :5 ‘-AATCTAGACTTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3，克隆到pGEM-T EASY载体，转化大肠杆菌感受态细胞DH5 α，挑取胺苄平板上长出的菌落进行培养，提取质粒、酶切鉴定。重组载体然后用Small和^CbaI酶切，GFP基因片段插入表达载体PKD6的Small和)(baI位点；转化大肠杆菌感受态细胞DH5 α，挑取胺苄平板上长出的菌落进行培养，提取质粒、酶切鉴定。将获得的验证正确的载体命名为PKD8-GFP。 (如附图5所示)。(5)红色荧光蛋白重组表达载体pKD8_DsRED的构建过程利用DsRED的PCR引物从pDsRED2经PCR获得DsRED基因片段，上游引物hi :5 ‘-AAcccgggATGGCCTCCTCCGAGAACGTCATC-3，下游引物h2:5 ‘-AATCTAGACAGGAACAGGTGGTGGCG-3，克隆到pGEM-T EASY载体，转化大肠杆菌感受态细胞DH5 α，挑取胺苄平板上长出的菌落进行培养，提取质粒、酶切鉴定。重组载体然后用Small和^CbaI酶切，DsRED基因片段插入表达载体PKD8的Small和)(baI位点；转化大肠杆菌感受态细胞DH5 α，挑取胺苄平板上长出的菌落进行培养，提取质粒、酶切鉴定。将获得的验证正确的载体命名为 pKD8-RED(如附图6所示)。实施例4S0D1启动子驱动DsRED在稻瘟病菌菌丝中的强表达ATMT法转化pKD6-RED载体到稻瘟病菌将载体pKD6_RED通过冻融法转化到农杆菌菌株AGLl。然后ATMT法转化稻瘟病菌萌发孢子中从新鲜培养的LB平板(含50mg/ ml卡那霉素)上挑选一农杆菌单菌落接种于5ml LB液体培养基(含50mg/ml卡那霉素)， 200rpm/minJ8°C过夜培养；第二天将200-400 μ 1培养液转移到5ml含50mg/ml卡那霉素的诱导液体培养基(IM)中，OD值约0. 15d8°C培养5 6个小时使0D600达到0. 5 0. 6 ；稻瘟病菌分生孢子的收集用IOml灭菌蒸馏水从培养大约10天的CM平板上洗下稻瘟病菌的分生孢子，三层擦镜纸过滤后用血球计数板计数，并用无菌水稀释孢子浓度为106 个/ml ；取100 μ 1培养好的农杆菌AGL-I (含载体)菌液和100 μ 1稀释好的稻瘟病菌分生孢子悬浮液混合，混合液QOO μ 1)均勻涂于IM平板上的硝酸纤维素膜表面，IM平板含 200ymol/L乙酰丁香酮(AS)或不含AS作为对照，22°C共培养48小时；然后将硝酸纤维素膜转移到含真菌抗生素(磺胺嘧啶)与抗生素的选择平板(DCM)上，选择性培养基中含 100 μ g/ml磺胺嘧啶、400mg/ml头孢霉素、60mg/ml链霉素，将平皿置于下培养到转化子出现；将转化子接种到含100 μ g/ml磺胺嘧啶DCM平板上再次鉴定。挑取具有磺胺嘧啶 (SUR)抗性的转化子在荧光显微镜下检测。结果表明SODl启动子驱动RED荧光蛋白在稻瘟病菌菌丝细胞质中的强烈表达，见图7。转pKD6-RED稻瘟病菌的转化子在CM培养基平板上培养12天，洗取稻瘟病菌孢子，稀释至孢子浓度为IX 105个/ml。孢子液20 μ 1—滴点接种于附着胞诱导表面上，28°C 诱导培养观-24小时，Trizol法提取RNA。DNase I处理RNA，然后RNA逆转录成cDNA，用 Real Time定量PCR检测SODl启动子驱动的DsRED基因的表达量，以β-tubulin的表达量最为对照。DsRED 的 Real Time qPCR 的引物为上游引物i 1 5，-AAGGCCCTGAAGCTGAAG-3，下游引物i2 :5，-GATGGTGTAGTCCTCGTTGTG-3，；β -tubulin 的 Real Time qPCR 的引物为上游引物j 1 5，-TCCCATCAACATCAGAATCCG-3，下游引物j 2 5，-GTTGTAAACTCCATTGCTGTCG-3，。Real Time定量PCR结果显示SODl驱动的DsRED的基因表达量是β -tubulin的 18倍。实施例4GAPDH蛋白在稻瘟病菌细胞内的亚细胞定位荧光融合蛋白载体的构建根据GAPDH的cDNA序列设计合成PCR引物上游引物kl :5，-TAggatccATGGTCAAGTGTGGTATC-3，下游引物k2 :5，-TAcccgggCTTGCCACCGTCAACCTT-3，PCR扩增包含整个基因编码区在内的GAPDH基因cDNA，然后克隆到pGEM_T EASY 载体，转化大肠杆菌感受态细胞DH5 α，挑取胺苄平板上长出的菌落进行培养，提取质粒、酶切鉴定。重组载体然后用SmaI和^CbaI酶切，GAPDH基因片段插入pKD6_GFP载体的BamHI
7禾口 SmaI位点。 ATMT法将荧光融合蛋白载体转化到丝状真菌。挑取具有磺胺嘧啶(SUR)抗性的转化子在荧光显微镜下观察GAPDH-GFP融合蛋白在稻瘟病菌细胞中的分布。利用PKD6-GFP 载体构建的GAPDH-GFP融合蛋白在稻瘟病菌中的表达结果表明如附图8所示，GAPDH蛋白定位于细胞质中。
权利要求
1.一种丝状真菌启动子，其特征在于所述的丝状真菌启动子或它的互补链具有SEQ ID NO. 1所示的碱基序列。
2.一种包含权利要求1所述的丝状真菌启动子的质粒。
3.—种丝状真菌终止子，其特征在于所述的丝状真菌终止子或它的互补链具有SEQ ID NO. 2所示的碱基序列。
4.一种包含权利要求3所述的丝状真菌终止子的质粒。
5.一种包含权利要求1所述丝状真菌启动子和权利要求3所述丝状真菌终止子的质粒。
6.根据权利要求5所述的质粒，其特征在于，包含抗性基因SUR或抗性基因ΝΕΟ。
7.根据权利要求5所述的质粒，其特征在于，包含GFP蛋白基因或红色荧光蛋白基因。
8.权利要求2、3或5所述的质粒在丝状真菌中表达蛋白、DNA或RNA中应用。
9.一种包含权利要求5 7任一所述质粒的转化子。
全文摘要
本发明公开了一种丝状真菌启动子、终止子和包含它们的质粒，所述的丝状真菌启动子，具有SEQ ID NO.1所示的碱基序列，所述的丝状真菌终止子具有SEQ ID NO.2所述的碱基序列。本发明启动子是一个强启动子，在稻瘟病菌的菌丝、孢子和附着胞阶段都高强度启动。该启动子基因属于表达强度在稻瘟病菌细胞内稳定性在前100位以内的基因。该基因是一个清除细胞内活性氧的重要基因，对于维持细胞的正常运转具有重要作用。该基因在活性氧诱导下可以大量诱导表达，用于合成大量的重组蛋白。
文档编号C12N1/15GK102154294SQ20111002739
公开日2011年8月17日 申请日期2011年1月26日 优先权日2011年1月26日
发明者卢建平, 张丽琳, 李海娇, 林福呈 申请人:浙江大学