专利名称：一种用cyp710a11基因培育抗胁迫转基因植物的方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及用番茄细胞色素P450基因CYP710A11， 通过基因工程等技术手段，培育抗胁迫植物，提高植物耐盐、耐干旱等抗胁迫的能力。
背景技术：
已知基因新功能的发掘利用，以及未知基因的功能研究，为拓展基因资源库及有效利用基因资源提供重要的依据，是基因功能研究的重要方向之一。干旱和土壤盐害是威胁全球农业生产最重要的逆境因子。加之气候变化、环境破坏使近年来干旱低温冷冻等极端天气加剧，使受干旱、盐害面积不断扩大，作物生产受到极大威胁。抗逆植物新材料的培育是一个持续而长久的课题，抗逆基因的发掘及利用具有重要意义。细胞色素P450 (Cytochrome P450，简称CYP450，P450)是一类以还原态与CO结合后在波长450nm处有吸收峰的含血红素的蛋白酶类，广泛存在于动物、植物、细菌、真菌等细胞内，是与内质网、线粒体、质体、高尔基体等细胞器膜结合的氧化还原酶类，其编码基因家族，是一个庞大的超基因家族。它们参与多种生物化学反应，其功能主要可归为两大类 1)参与生物合成途径，2)参与生物解毒途径贺丽虹等，2008。截止2010年，已鉴定了 11500 多个 P450 蛋白http://en. wikipedia. org/wiki/Cytochrome P450。在植物体内，P450基因估计占已知基因的Mizutani M&Ohta D. 2010，是高等植物中最大的酶蛋白家族，广泛地催化单加氧/羟基化反应，合成多种初级和次生代谢产物如苯丙烷类，生物碱，萜类，脂肪酸，生氰糖苷，硫甙类和植物激素等，而且参与许多外源性物质包括除草剂、农药等的生物氧化MA S&fferck-Reichhart D. 2003 ；Nelson DR, et al. 2008。有关细胞色素P450基因的研究极其繁多，主要集中在它们的生物合成和生物解毒功能上。它们催化产生的一些重要次生代谢产物，在植物抵抗病虫害及生产重要药用价值的天然化合物中，具有重要作用。并能分解有毒物质如除草剂、农药等，使植物抵抗有毒逆境的胁迫杨致荣等，2003 ；贺丽虹等，2008。迄今仍然有大部分的P450基因的功能未得到鉴定，拟南芥中含有246个P450基因，其中只有约60个通过突变体或者异源表达鉴定了功能，尚有70%未被鉴定Mizutani M&Ohta D.2010。目前尚没有关于它们在植物干旱、盐害等非生物胁迫中作用的报道。在植物基因工程研究中，P450基因的利用，多集中在生产具有重要医药价值的天然化合物iTakemura T, et al. 2010 ；Pfalz M，2011 Jensen K，2011 ，提高植物对病原菌的抗性Cheng Dff et al,2010 ；Griebel T&Zeier J，2010，提高植物解毒能力如培育抗除草剂新材料Xia XJ et al,2009 ；Busi R，et al 2010，培育能清除污染环境的修复植物 [Van Aken B，2009等。而有关P450用于抗干旱、高盐、低温等非生物逆境的基因工程研究，未见报道。在植物中，细胞色素P450大家族中CYP710A亚家族基因编码留醇C_22去饱和酶。 目前获得的编码基因有 CYP710A1、CYP710A2、CYP710A3、CYP710A4、CYP710A5、CYP710A6、 CYP710A7、CYP710A8 和 CYP710A11。其中 CYP710A1 CYP710A4 来自拟南芥(Arabidopsisthaliana) ,CYP710A5 CYP710A8 来自水稻(Oryza Sativa)，CYP710A11 来自番茄(Solanum lycopersicum) [Morikawa T. et al,2006 ；Nelson DR, et al，2004，2008。其中来自拟南芥的CYP710A1和来自番茄的CYP710A11基因具有相同的功能，编码的甾醇C-22去饱和酶催化谷留醇生成豆留醇，是留醇合成途径中的关键酶，在留醇合成中起重要作用。在转基因拟南芥中过量表达CYP710A11基因，能提高豆甾醇含量6- 倍 [Morikawa Τ. et al，2006。另外，CYP710A11在番茄果实成熟过程中表达增加，同时豆甾醇含量也增加Whitaker BD and Gapper NE, 2008 Morikawa Τ.等和 Whitaker BD 等分离克隆的番茄CYP710A11基因在GenBank中的登录号分别为ΑΒ223043和EU224275。脱落酸(Abscisic acid, ABA)调节植物对非生物逆境的抗性得到广泛的证实，脱落酸一个很重要的功能是调节植物对环境的适应性，在提高植物对逆境胁迫如干旱、高盐、 低温的耐受力方面，发挥重要的作用，有关研究已有大量的报道Hirayama，T&Shinozaki, K，2007，2010。了解ABA与CYP710A11基因的关系，有助于了解该基因的抗逆功能。目前还没有关于CYP710A11基因是否具有调节植物抗逆境胁迫功能的报道，亦没有在提高植物抗逆境胁迫中应用的报道。本发明从番茄中分离克隆了 CYP710A11基因，该基因⑶S长度为1506bp，编码长度为501个氨基酸的蛋白质。通过荧光定量PCR技术研究，表明CYP710A11基因受脱落酸 (Abscisic acid，ABA)诱导表达。通过转基因功能验证，鉴定了 CYP710A11基因具有显著提高植物对高盐、干旱和高渗透、ABA胁迫、重金属胁迫等耐受力的功能。环境胁迫(干旱、盐、重金属等)对植物的生长有很大的影响。传统育种方法培育新的抗逆品种周期长且见效慢，转基因方法见效快，但又不影响其他已有的好的性状，逐渐成为抗逆品种改良的主要方法。本发明所提供的番茄P450基因CYP710A11在烟草中过量表达，使得转基因植株比野生型植株明显增强了对高盐、干旱、ABA胁迫、重金属胁迫的耐受性。表明CYP710A11基因具有抗非生物逆境的功能，能显著提高转基因烟草抗逆境胁迫如干旱、高盐、重金属胁迫的能力，在多种环境条件胁迫下对植物起保护作用。因此， CYP710A11基因可以作为一个有效的目标基因用于培育其他耐高盐或者耐干旱或者耐重金属的转基因植物。
发明内容
本发明的目的在于，提供一个番茄P450基因CYP710A11在提高植物抗非生物胁迫方面的应用，以拓展基因CYP710A11的应用范围。本发明的目的还在于提供番茄P450基因CYP710A11在培育抗逆转基因植物方面的应用。本发明所述的CYP710A11基因cDNA全长是从番茄幼苗中克隆获得，登录GenbanK 获得编号为JN388603。本发明所提供的番茄甾醇C-22去饱和酶，名称为CYP710A11，来源于茄科 (Solanaceae) ^jp M (Solanum)番爺(Solanum lycopersicum),具有序列表中的 SEQ ID No. 2氨基酸残基序列的蛋白质。上述番茄甾醇C-22去饱和酶编码基因(CYP710A11)，具有序列表中SEQ ID No. 1 的DNA序列。
序列表中的SEQ ID No. 1由1506个碱基组成，为一个完整的开放读码框，编码501 个氨基酸的蛋白。与GenbanK中公布的CYP710A11基因序列AB223043和EU2M275，同源性极高，达到99%以上。所述的基因CYP710A11受ABA诱导表达，在逆境胁迫中发挥作用。具体而言，本发明的技术方案采用了一个番茄P450基因CYP710A11在培育抗胁迫转基因植物方面的应用。将CYP710A11基因连接到植物表达载体上，构建该基因过表达载体，转化获得抗逆境胁迫的转基因植物。含有本发明基因的表达载体、细胞系和宿主菌均属于本发明的保护范围，包括大肠杆菌、农杆菌、植物细胞。本发明利用转基因技术揭示了 CYP710A11基因在逆境胁迫中的作用。本发明利用甘露醇高渗透压胁迫试验，确定了 CYP710A11基因在高渗透胁迫中能显著提高转基因植物的抗性。本发明利用人工干旱控水胁迫试验，确定了 CYP710A11基因在干旱透胁迫中能显著提高转基因植物的抗性。本发明利用NaCl高盐胁迫试验，确定了 CYP710A11基因在高盐胁迫中能显著提高转基因植物的抗性。本发明利用CuSO4胁迫抗性试验，确定了 CYP710A11基因在高含量重金属Cu2+离子胁迫中能显著提高转基因植物的抗性。本发明的CYP710A11基因在构建到植物表达载体中时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种组成型启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择标记(GUS基因、GFP基因等)或具有抗生素抗性的基因(氨基糖苷类抗性基因nptll，潮霉素抗性基因hpt等)。被转化的植物宿主可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如水稻、小麦、玉米、黑麦草、烟草、番茄、 黄瓜、草坪草、苜蓿等。携带有本发明的CYP710A11基因表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物技术转化植物细胞或组织，并将转化的植物经组织培养成植株。本发明提供了一个能提高受体植物耐高盐、耐干旱、耐重金属能力的基因，通过转基因的方法将该基因导入受体植物中，能显著提高转基因植物对高盐、干旱、重金属的耐受能力。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明，但是这些图片和具体实验是示例性的，不能将它们视为对本发明的限制。图1.高盐(NaCl，200mmOl/L)胁迫下，烟草在培养基中的生长状况。其中W为对照野生型；PI、P2、P3分别为3个转CYP710A11基因株系。培养42d后测定鲜重，方差分析及显著性检验表明，差异显著P <0.01。转基因植株的生长情况明显优于野生型。图2.不同浓度甘露醇胁迫下，烟草在培养基中的生长状况。其中W为对照野生型； P1、P2、P3分别为3个转CYP710A11基因株系。转基因植株的生长情况明显优于野生型。
具体实施例方式下面实施例对本发明作进一步说明，但是这些具体实验是示例性的，不能将它们视为对本发明的限制。实施例1CYP710A11基因的分离克隆以番茄(Solanum lycopersicum)Mill. cv. Ailsa Craig，播种在盆钵中，温室中培养，以生长2-3周的幼苗作试验材料。用Trizol试剂盒(Invitrogen)从番茄幼苗中提取总RNA，用逆转录试剂盒(TaKaRa)合成cDNA。根据GenBank数据库CYP710A11基因登录号为AB223043和EU224275所示的序列， 分析序列的开放阅读框和酶切位点，应用I^rimer 5. O软件设计引物并合成。在起始密码子和终止密码子两端均加上相应的酶切位点，以便进行载体构建。AB223043是Morikawa T等从番茄中克隆的Morikawa Τ. et al，2006，EU224275 是 Whitaker BD 和 Gapper NE 从番茄栽培品种 Rutgers 中获得的WhitakerBD and GapperNE，2008。扩增引物如下上游引物(BamHI) 5’ GGATCCATGGCATCCATTTGGGGTTTGTTA 3，下游引物(KpnI)5，GGTACCTCATCGTGTGCACCTGTGTGCAAG 3，用高保真Tag酶(TaKaRa)进行PCR扩增，获得目的片段约1500bp，回收片段克隆到PMD18-T载体(TaKaRa)中并测序(上海生工)。获得该基因cDNA完整的开放读码框，共 1506bpo利用Genebank BLAST进行序列比对，用DNAMAN软件进行氨基酸序列同源性分析， 结果表明与Genebank数据库CYP710A11基因序列(AB223043)同源性达到99%，有6个碱基的差异；氨基酸序列5个残基的差异，同源性达99%。与GenBank中EU224275同源性高达99. 93%，只有1个碱基差异；氨基酸序列1个残基的差异，同源性达99. 8%。表明获得的基因是番茄CYP710A11基因，核苷酸序列和氨基酸序列见SEQ ID No. 1和No. 2。含有该基因的 PMD18-T 载体命名为 pMD18-T-CYP710All。实施例2ABA诱导的CYP710A11基因表达分析番茄(Solanum lycopersicum)小康2号种子(购自成都科农实业有限公司)，播种在盆钵中，温室中培养，以生长2-3周的幼苗作试验材料。试验分为2组进行。一组用 2mg/L的ABA喷施叶片；一组用清水作为对照处理喷施叶面。每个处理组共3个重复，每个重复10株幼苗。Mir后取叶片，提取RNA (Trizol试剂盒，Invitrogen)并反转录(反转录试剂盒，TAKARA)合成为cDNA模板。选取植物中保守的Actin基因作为内参基因，扩增片段约180bp，所用引物为ACT-F :5’ GGGATGATATGGAGAAGATA 3’ACT-R :5’ AGTACAGCCTGAATAGCAAC 3’根据CYP710A11基因设计荧光定量引物，扩增片段184bp，所用引物为CYP-F :5，CTTCTACTTCTGCTCTGT 3，CYP-R :5’ GCTCTGATTCTGATTATCTC 3’SYBRgreenz染料法进行荧光定量PCR检测CYP710A11基因的表达。结果表明，ABA 诱导下，CYP710A11基因表达量显著提高，表达量是对照的2. 5 5. 4倍(P < 0. 05)。实施例3番茄CYP710A11基因植物过表达载体构建
将实施例1中获得的含有CYP710A11基因的载体pMD18-T-CYP710All，经过相应的 BamH I和Kpn I双酶切，T4连接酶(NEB)连接，构建到植物表达载体p235马欣荣，2008
中，命名为P23-CYP710A11。质粒p2355由本实验室在pCAMBIA2301 (获得CAMBIA使用许可)基础上构建，长度为12577bp，具卡那霉素抗性基因和GUS标记基因；含1个启动子、终止子单元，其间是多克隆位点区，外源片段由此插入。将构建的载体p23-CYP710All冻融法导入根癌农杆菌EHA105中，液氮保存。实施例4培育抗逆能力增强的转基因烟草转化过程中用于烟草培养的培养基见表1。1.烟草遗传转化取饱满的烟草成熟种子，用70%乙醇清洗lmin，然后浸泡于活性氯含量4%的次氯酸钠溶液中振荡lOmin，用无菌水清洗4-5次；接种于含MS培养基的培养皿中，25°C，暗培养5d后，进行光培养，光周期为1 光/ 暗；20-30天，萌发生长出无菌苗后待用；将无菌苗接到含MS培养基的培养瓶中生长，每30天换一次培养基，无菌苗可以通过试管苗繁殖并保存。从液氮罐中取出冻存的EHAp23-CYP710All，蘸取菌液于LB+利福平(Rif)25mg/ L+卡那霉素(Kan) 50mg/L的平板上划线培养，观°C，3天；从平板上挑取农杆菌单菌落，接种到LB+利福平(Rif) 25mg/L+卡那霉素(Kan) 50mg/L的液体培养基中，观°C，摇床2rpm 培养过夜；取培养过夜的菌液，按-2%的比例，转入新配制的无抗生素的液体共培养基 (COM) +200 μ mol/L 乙酰丁香酮(AS)中。28°C，200rpm 培养 5h 左右，OD600 为 0. 4-0. 6 即可用于转化。取无菌培养的烟草叶片，将叶片剪成约0.5cm见方的小块并划网状裂纹；将农杆菌菌液和叶片混勻，浸泡IOmin后取出叶片，置于无菌滤纸上吸去多余的菌液，将烟草叶片置于共培养基(COM)中，共培养3d。共培养后的烟草叶片置于无菌滤纸上，吸去多余的农杆菌；将烟草叶片转至选择分化培养基(SR)中进行培养，25°C，1 光照/8h暗，约2周后长出丛生芽，再移入新的选择培养基中继代培养2周。之后将小苗剥离，放置到生根选择培养基(冊)中培养，25°C，1 光照/ 暗，培养30天，期间更换一次培养基。待植株生根后，株高约5-lOcm时，移出培养瓶，于盆钵中栽培。并进行转基因植株检测。表1.烟草遗传转化过程中使用的培养基
权利要求
1.一种用CYP710A11基因培育抗胁迫转基因植物的方法，其特征是将番茄(Solanum lycopersicum)基因CYP710A11连接到不同种类植物表达载体上，通过不同的表达载体转化获得抗逆的转基因植物。
2.根据权利要求1所述的培育抗胁迫转基因植物的方法，其特征在于所述的 CYP710A11基因⑶S长度为1506，编码501个氨基酸的蛋白。
3.根据权利要求2所述的培育抗胁迫转基因植物的方法，其特征在于所述的基因 CYP710A11编码一种细胞色素P450蛋白甾醇C-22去饱和酶(sterol 22-desaturase)。
4.根据权利要求3所述的培育抗胁迫转基因植物的方法，其特征在于所述的基因 CYP710A11的表达受逆境胁迫激素ABA的诱导。
5.根据权利要求1所述的培育抗胁迫转基因植物的方法，其特征在于所述的植物包括烟草和其他植物。
全文摘要
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及用番茄细胞色素P450基因CYP710A11，通过基因工程等技术手段，培育抗胁迫植物，提高植物耐盐、耐干旱等抗胁迫的能力。将番茄(Solanum lycopersicum)基因CYP710A11连接到不同种类植物表达载体上，通过不同的表达载体转化获得抗逆的转基因植物。本发明能显著提高转基因植物对高盐、干旱、重金属的耐受能力。
文档编号C12N15/82GK102304532SQ20111021540
公开日2012年1月4日 申请日期2011年7月29日 优先权日2011年7月29日
发明者栗丹, 毛萍, 马欣荣 申请人:中国科学院成都生物研究所