专利名称：一种核苷类抗生素a201a高产菌株及其构建方法
技术领域：
本发明属于海洋微生物基因工程和代谢工程领域，具体涉及一种通过基因工程对 M. thermotolerans SCSIO 00652的链霉素中核苷类抗生素A201A的生物合成基因簇进行遗传改造，使mtdA的基因失活而获得核苷类抗生素A201A高产的M. thermoto lerans SCSIO 00652 突变株 Ju3001。
背景技术：
在过去的十年间，海洋放线菌已成为新颖生物活性天然产物发现的新源泉。例如，Salinispora属放线菌，可产生多种结构新颖和生物活性广泛的化合物，如海洋放线菌 Salinispora tropica可产生化合物salinosporamide A，作为高效的蛋白酶体抑制剂该化合物已经进入癌症治疗的临床试验了。本研究单位(中国科学院南海海洋研究所)从中国南海北部深海海沟的沉积土里分离得到一个放线菌新属菌种M. thermoto lerans SCSIO 00652，该菌株的发酵液对革兰氏阳性菌和阴性菌均具有抑制作用。与抗生素生物合成相关的基因往往成簇排列，包括自我抵抗基因、转运基因和调控基因。抗生素生物合成基因簇成功克隆后，可利用分子生物学基础上的组合生物合成 (combinatorialbiosynthesis)禾口代谢工禾呈(metabolic engineering)技术来定向创造新结构、新活性化合物或者提高抗生素的产量，这无疑将大大丰富已有的资源，从而为解决或部分解决临床上病原微生物的耐药性日益严重的问题。近年来发展起来的PCR-Targeting技术和接合转移技术已在多种链霉菌中成功应用。PCR-Targeting技术是以RED重组技术为基础的，RED同源重组系统由源于λ噬菌体的exo、bet、gam基因组成，在这3个基因产物的作用下，该系统能介导36bp以上的同源片段产生同源重组。接合转移技术是发生在大肠杆菌与链霉菌之间，可以避开胞外核酸酶的影响，使DNA免遭核酸酶的降解，在某种程度上可以克服宿主对外源DNA的限制性修饰从而提高转化效率，而且操作程序简单，因此应用较为广泛。PCR-Targeting技术和接合转移技术为通过基因工程对链霉素中抗生素生物合成基因簇进行遗传改造提供了一种方便而有效的途径。核苷类抗生素A201A，其结构如式(I)所示，具有广谱抑菌性，对革兰氏阳性菌和阴性菌都有抑制作用，对Maphylococcus aureus具有抗菌活性，对卤虫(Artemia salina)
具有致死性。
权利要求
1.一种核苷类抗生素A201A高产菌株M. thermotolerans SCSIO 00652突变株Ju3001， 其特征在于，该核苷类抗生素A201A高产菌株Μ. thermotolerans SCSIO 00652突变株 Ju3001是mtdA基因失活的Μ. thermotolerans SCSIO 00652，所述的mtdA基因的序列如 SEQ IDN0. 1 所示。
2.一种权利要求1所述的核苷类抗生素A201A高产菌株M. thermotolerans SCSIO 00652突变株Ju3001的构建方法，其特征在于，是将M. thermotolerans SCSIO 00652的 mtdA基因失活，由此获得核苷类抗生素A201A高产菌株M. thermotolerans SCSIO 00652突变株Ju3001，所述的mtdA基因的序列如SEQ ID NO. 1所示。
3.根据权利要求2所述的核苷类抗生素A201A高产菌株MthermotoleransSCSIO 00652突变株Ju3001的构建方法，其特征在于，所述的将Μ. thermotolerans SCSIO 00652 的 mtdA 基因失活是以 MtdAdelF 5' -gccgacctgctggagaccttctccgtcctggccgaggtgattccg gggatccgtcgacc-3 ； MtdAdelR 5' -gcacagccagttctcgacctccaggacgtgcatggtggctgtaggct ggagctgcttc-3'作为mtdA基因敲除引物，用PCR-Targeting进行同源重组，将同源重组的 cosmid与野生型的M. thermotolerans SCSIO 00652进行接合转移对mtdA基因进行阅读框取代，而构建得到mtdA基因失活的M. thermotolerans SCSIO 00652突变株Ju3001。
4.一种在抗生素A201A生物合成作为负性调控子发挥作用的mtdA基因，其特征在于， 其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
5.一种权利要求4所述的mtdA基因编码的蛋白质，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ IDN0. 2 所示。
全文摘要
本发明公开一种核苷类抗生素A201A高产菌株及其构建方法。核苷类抗生素A201A高产菌株M.thermotolerans SCSIO 00652突变株Ju3001是mtdA基因失活的M.thermotolerans SCSIO 00652，所述的mtdA基因的序列如SEQ ID NO.1所示。本发明的通过失活M.thermotolerans SCSIO 00652的核苷类抗生素A201A生物合成基因簇上游的负性调控子mtdA基因而得到mtdA基因失活的M.thermotolerans SCSIO 00652突变株Ju3001，该M.thermotolerans SCSIO 00652突变株Ju3001的核苷类抗生素A201A产量是野生型的M.thermotolerans SCSIO 00652菌株的25倍。因此，该抗生素A201A高产菌株M.thermotolerans SCSIO 00652突变株Ju3001的成功构建使抗生素A201A的产业化成为可能。
文档编号C12N15/31GK102373171SQ20111034090
公开日2012年3月14日 申请日期2011年11月1日 优先权日2011年11月1日
发明者张长生, 朱清华, 李军, 田新朋, 鞠建华, 马俊英 申请人:中国科学院南海海洋研究所