专利名称：一种植物抗逆蛋白AcTPR及其编码基因的应用的制作方法
技术领域：
本发明属植物基因工程技术领域，具体涉及运用酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae INVScl菌株表达一种与植物抗逆相关的蛋白AcTPR。
背景技术：
自然界中存在多种如盐、碱、高温、低温、干旱、病虫害等多种生物和非生物胁迫， 限制了作物的生长发育，从而影响作物产量直接威胁到粮食安全，因此，将抗逆境胁迫的基因转入作物中进行分子育种改良作物性状引起了科研工作者的兴趣。而克隆逆境相关基因及其功能的研究能够为通过基因工程进行植物抗逆育种提供有价值的信息和材料。但是， 当前很多研究主要集中在草本植物，很少对木本植物特别是盐生木本植物进行分子遗传学的研究。木本植物和草本植物应对生物和非生物胁迫时在结构、生长、发育以及生理等方面存在差异性，因此克隆和研究木本植物中与抗逆相关的基因能够为通过基因工程提高作物对生物和非生物胁迫的抗受力提供更多的候选基因。四翅滨藜(Atriplex canescens[Pursh]Nute)是藜科，滨藜属木本植物，是干旱、 半干旱地区的典型植物，可生长在沙丘、砾沙土、山脊、斜坡和冲击平原上。在年降雨量 180mm以上，年均气温5°C左右，极端最低温度_40°C的干旱、半干旱荒漠、盐碱地生长良好， 种源产地海拔2377m，人工栽植区已达3150m。据报道，四翅滨藜可生长在可溶性盐含量为 1%，土壤盐分在307 169;3mg/kg的土壤中，在可溶性盐含量超过42^mg/kg的土壤中也生长良好。在印度，从美国等国引进了 12种滨藜品种改良了 700万hm2的盐碱地，突尼斯和北非一些国家为开发盐碱地资源已有2万hm2荒漠地种植了滨藜，在澳大利亚、南非、北非、 以色列和北美地区滨藜是干旱半干旱地区最主要的饲料灌木之一，也是绿化和水土保持的优良树种。近几年先后在我国甘肃、青海、新疆、宁夏等地进行了区域性引种栽培试验，显示了极强的抗干旱、低温、贫瘠、抗盐碱等优良特性。酿酒酵母菌&iccharomyces cerevisiae不仅具有生长快、容易培养和易于遗传操作等优点，而且具有典型真核系统的特性，具有糖基化、二硫键形成以及蛋白质折叠等翻译后加工等过程，其表达模式与植物表达模式更为接近，所以用酵母筛选植物抗逆基因具有原核表达系统不可替代的优越性。采用酵母突变体筛选植物的不同cDNA文库来鉴定和挖掘新基因的方法已经广泛应用于植物功能基因的研究。用酵母的2种不同氨基酸转运缺陷突变体筛选拟南芥cDNA文库，Frommer等和Hsu等(1993年)成功地克隆到相应的编码相同氨基酸透过酶的NAT2/AAP1。酵母表达系统还被广泛地应用到植物抗盐基因功能研究中，Yamada等(2002年)利用酵母表达体系验证了丙二烯环化氧化酶(AOC)基因大大增强转化子的抗盐性，从而表明AOC基因在真核表达系统中增强抗盐胁迫的功能。唐玉林等 (2007年)利用酵母表达系统研究大豆SAL 13-2蛋白功能，将大豆SAL 13-2蛋白cDNA及其缺失片段构建到酵母表达载体PYES2上，并转化酵母菌INVkl，检测酵母重组子在胁迫条件下的生长状况，结果表明，SALI3-2基因可明显提高酵母转化子的抗盐能力。酿酒酵母菌株INVkl (基因型为MATa his3Dl leu2 trpl-289 ura3_5》是一种二倍体，并且生长迅速的理想酵母表达菌株，该菌株是人工改造的尿嘧啶营养缺陷型菌株，运用SC-U培养基筛选转化子，假阳性率低，能够保证转化效率。 IPR蛋白家族在原核和真核细胞中均广泛存在，IPR结构域可能介导蛋白之间的相互作用，对于某些蛋白复合物的形成非常重要，Tra蛋白中串行排列的多个Tra序列可能分别介导与不同蛋白的互作，从而使Tra蛋白在不同的情况下发挥不同的功能。Tra基序是一个含有34个氨基酸的串行排列的重复序列。这些共有重复序列具有简并性。不同的 IPR蛋白中的TPR重复数目并不相同，一般为3-16个。各基序的氨基酸组成和排列也不完全相同，但是在某些位点具有高度保守性如第8、20、27位多是小的，不带电荷的氨基酸如甘氨酸、丙氨酸、第4、17、24位多是芳香族氨基酸如酪氨酸或苯丙氨酸，第21、28位则是大的脂肪族氨基酸。此外，基序末端尤其是32位上多含脯氨酸。IPR保守域还可能成为蛋白复合物构成中的重要的桥梁，在钙调素与蛋白结合的过程中发挥着重要作用。而且IPR还参与细胞循环、转录抑制、胁迫响应、抑制蛋白激酶和蛋白复合体的运输等过程，还可以调节蛋白与蛋白之间的相互作用。其中，转化pYES-AcIPR重组载体的酵母INVScl菌株在抗低温和碱胁迫中表现出较强抗性，在众多研究中，还未有关含Tra功能域的四翅滨藜基因在酵母抗逆和植物的抗逆生理功能方面的相关报道。
发明内容
本发明采用盐生灌木植物四翅滨藜(Atriplex canescens)作为研究材料，通过构建低温(-10°C )和盐(400mM NaCl)胁迫下四翅滨藜的全长运用Invitrogen公司 SuperScript Full-Length cDNA Library Construction Kit 构建全长 cDNA 文库，并通过 Gateway技术LR重组到酵母表达载体pYES_DEST52中，混合质粒转化酵母菌株INVScl，通过多种模拟逆境胁迫(盐碱、冻害、高温、SOS胁迫、干旱胁迫)筛选出与逆境胁迫相关的基因，为今后利用抗盐碱、干旱、冻害、SOS胁迫基因获得抗相应逆境胁迫的转基因农作物和林木奠定基础，同时也为四翅滨藜抗盐碱和抗低温分子机制研究提供依据。本发明使用酵母表达载体pYES_DEST52(购自Invitrogen公司)，插入本发明 AcTPR蛋白核苷酸编码序列以及得到重组表达载体pYES-AcIPR，它除了携带有AcIPR蛋白核苷酸编码序列外，还有T7启动子、GALl启动子、CYCl终止转录信号、URA3基因、fl复制基因、PUC复制基因、酵母2 μ复制序列、氨苄青霉素抗性基因、attRl和attR2用于LR重组的重组位点、致死基因ccdB用于逆向筛选转化子、氯霉素抗性基因用于对阳性转化子的双重筛选、V5印itope便于重组后蛋白表达检测、6xHis Tag用于重组基因纯化，以及为外源蛋白高效表达所需的各种调控元件。AcIPR基因由1631个碱基组成，含有一个完整的开放阅读框架(Open Reading Frame) 134Ibp，同时还提供5，-UTR和3，-UTR序列，AcTPR为序列表中的SEQ ID N0:1序列。开放读码框的起始密码子为ATG，终止密码子为TGA。本发明的一个目的是提供含IPR功能域的四翅滨藜中与植物抗逆相关的蛋白及其编码基因并进行应用。本发明提供一种植物抗逆相关蛋白名称为AcIPR(Atriplex canescens Tetratricop印tide repeat domain)，来源于四翅滨藜，包含如下两类蛋白质
(a)由序列表中SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中SEQ ID NO 2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代或缺失或添加且与植物抗逆性相关的由序列表中SEQ ID NO :2衍生的蛋白质。序列表中SEQ ID NO 2由446个氨基酸残基组成，其中86个疏水氨基酸，360个亲水氨基酸，亲水性极强，81个碱性氨基酸，85个酸性氨基酸，蛋白质分子量为51. 2kD，等电点为5. 31。四翅滨藜AcTPR蛋白未见报道。植物抗逆性相关蛋白AcTPR的编码基因AcIPR的编码序列为序列表中SEQ ID NO 1的5，端第93-1434位脱氧核苷酸。植物抗逆性相关蛋白AcIPR的编码基因AcIPR的编码序列为下列之一1)编码序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO 1所示；2)编码序列表中SEQ ID NO 2蛋白序列的核苷酸分子；3)与1)所述的核苷酸序列具有90%以上的同源性且编码植物抗逆相关蛋白 AcTPR的核苷酸分子；4)在高严谨条件下与1)所述的核苷酸序列杂交且编码植物抗逆相关蛋白AcIPR 的核苷酸分子。以上4)中所述高严谨条件是指可为在0. 1XSSC，0. 1% SDS的溶液中、65°C下杂交并洗膜的条件。一种重组表达载体含有植物抗逆相关蛋白AcIPR的编码基因AcTPR。一种重组菌含有植物抗逆相关蛋白AcIPR的编码基因AcTPR。(以下简称编码基因 AcTPR)。为了使(a)中的蛋白AcIPR便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或梭基末端连接上如表1所示的标签。表1.标签的序列
权利要求
1.一种植物抗逆相关蛋白AcTPR，其特征在于其中包含如下两类蛋白质(a)由序列表中SEQID NO :2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中SEQID NO 2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代或缺失或添加且与植物抗逆性相关的由序列表中SEQ ID NO :2衍生的蛋白质。
2.按权利要求1所述植物抗逆相关蛋白AcIPR的编码基因AcTPR，其特征在于所述的编码基因AcITR的编码序列为序列表中SEQ ID NO=I的5，端第93-1434位脱氧核苷酸。
3.按权利要求2所述植物抗逆相关蛋白AcIPR的编码基因AcTPR，其特征在于所述编码基因AcIPR的编码序列为下列之一1)编码序列的核苷酸序列如序列表中SEQID NO 1所示；2)编码序列表中SEQID NO 2蛋白序列的核苷酸分子；3)与1)所述的核苷酸序列具有90%以上的同源性且编码权利要求1所述植物抗逆相关蛋白AcIPR的核苷酸分子；4)在高严谨条件下与1)所述的核苷酸序列杂交且编码权利要求1所述植物抗逆相关蛋白AcIPR的核苷酸分子。
4.一种重组表达载体，其特征在于含有权利要求2或3所述植物抗逆相关蛋白AcTPR 的编码基因AcTPR。
5.一种重组菌，其特征在于含有权利要求2或3所述植物抗逆相关蛋白AcTPR的编码基因AcTPR。
全文摘要
一种植物抗逆蛋白AcTPR及其编码基因的应用属植物基因工程技术领域，本发明提供一种植物抗逆相关蛋白AcTPR，包含由SEQ ID NO2氨基酸序列组成和将SEQ ID NO2的氨基酸序列经一个或几个氨基酸残基的取代或缺失或添加且由SEQ ID NO2衍生的蛋白质；编码基因AcTPR的编码序列如下列之一a.编码序列的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示；b.编码SEQ ID NO2蛋白序列的核苷酸分子；c.与a核苷酸序列具有90％以上同源性且编码蛋白的核苷酸分子；d.与a的核苷酸序列杂交且编码蛋白的核苷酸分子；将AcTPR导入酿酒酵母得到的转基因酿酒酵母，可提升酵母耐低温耐NaHCO3能力。
文档编号C12N1/19GK102391368SQ20111040146
公开日2012年3月28日 申请日期2011年12月6日 优先权日2011年12月6日
发明者余刚, 刘金亮, 张世宏, 李敬涛, 李桂华, 潘洪玉, 贾承国, 陈宣明 申请人:吉林大学