专利名称：用于检测h5亚型禽流感病毒的重组ha蛋白及其编码基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于检测H5亚型禽流感病毒的重组HA蛋白及其编码基因。
背景技术：
禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)是一种能引起禽类发生严重急性传染病的A型流感病毒，其引起的禽流感被国际兽疫局(OIE)列为类A动物传染病。该病毒很容易发生变异，至今已发现了 16个血凝素(HA)和9个神经氨酸酶(NA)亚型。其中，H5是一种高致病性亚型AIV，能引起禽类大规模死亡并给养禽业造成巨大的经济损失。有证据表明，H5亚型AIV还能通过多种途径传播给人类及其它多种哺乳动物，如猫、狗、猪和虎等， 导致其发病甚至死亡。因此，快速准确检测H5亚型禽流感病毒感染对该病的排查和防控具有重要意义。AIV基因组由8个独立的RNA组成，共编码10种蛋白。其中，HA蛋白是AIV的一个重要的表面抗原性蛋白，在病毒的吸附和穿膜、决定病毒致病力等方面起重要作用，也是病毒刺激机体产生中和抗体的重要抗原，在AIV的免疫学诊断中有重要意义。至今为止，有关该病的血清学诊断技术包括血凝抑制试验(HI)、琼脂扩散试验 (AGP)、免疫荧光技术(IFA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)等。血凝抑制试验(HI)是禽流感及其亚型鉴定的常用方法，但操作复杂费时，需要与血凝试验(HA)同时进行，而且对于具有相同神经氨酸酶亚型(NA)的病毒感染容易发生交叉反应，导致误诊。琼脂扩散试验(AGP)是利用可溶性抗原抗体在琼脂糖凝胶内扩散，当抗原抗体发生免疫反应时，在琼脂糖凝胶内形成肉眼可见的免疫复合物沉淀线，并依此判定结果。该方法特异性差、敏感性低，容易造成误诊。免疫荧光技术(IFA)是一种将免疫学方法与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。该方法最早在1961年用于人类流感的快速诊断，在禽流感的诊断上也有应用。该方法具有敏感、快速、简便、成本低等特点，但也存在非特异性荧光干扰而出现的假阳性结果问题。酶联免疫吸附试验(ELISA)是一类以酶标抗原或酶标抗体为主要试剂，通过复合物中的酶催化底物呈色而对被检物进行定性或定量的标记免疫技术。该技术具有灵敏度高、特异性强、准确性好、操作简单方便等特点，是目前对病毒抗原及其抗体检测的常用技术。该技术最早于1974年被欧洲国家应用于禽流感的检测，目前我国研发的禽流感ELISA 诊断方法包括禽流感病毒检测ELISA和禽流感抗体检测ELISA两种。这两种技术所使用的抗原是全病毒浓缩抗原，需要通过浓缩、纯化和灭活等工艺来制备。禽流感病毒是一种很容易变异的病毒，具有潜在性生物安全危害。尤其是H5亚型禽流感病毒，是一种高致病性病毒，制备抗原时要求在至少P3级的生物安全设施中生产。生产成本大、仪器设备要求高，不能满足实际生产需要，不利于这些技术的推广应用。针对这些问题，有学者以血凝素(HA) 基因表达蛋白为抗原建立禽流感ELISA检测技术，并已证明可用于对禽流感病毒的HA亚型进行分型。但由于HA基因中含有较多的大肠杆菌稀有密码子，HA全长基因在原核细胞中进行表达时，序列中密集分布的稀有密码子会对重组蛋白的表达产量有很大影响，无法满足生产需要；而且这些稀有密码子分布广泛，对其进行改造需要耗费很大的人力和物力，大幅度增加研发成本。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测H5亚型禽流感病毒的重组HA蛋白及其编码基因。所述蛋白为如下a)或b)的蛋白质a)由序列表序列2所示氨基酸序列组成的蛋白质； b)将序列表序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和 /或添加且可与H5亚型禽流感病毒的抗血清特异结合的蛋白。序列表序列2所示的氨基酸序列由244个氨基酸残基组成，含有H5亚型禽流感病毒的HA抗原表位。为了使上述(a)中的蛋白便于纯化，可在由序列表序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表I所示的标签。表I标签的序列
权利要求
1.一种蛋白质，是如下a)或b)的蛋白质a)由序列表序列2所示氨基酸序列组成的蛋白质；b)将序列表序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且可与H5亚型禽流感病毒的抗血清特异结合的蛋白。
2.根据权利要求I所述的蛋白，其特征在于所述蛋白质为在序列表序列2所示氨基酸序列的氨基末端添加6个组氨酸的蛋白。
3.编码权利要求I或2所述蛋白质的基因。
4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于编码权利要求I或2所述蛋白质的基因为如下I)或2)或3)的基因1)其核苷酸序列是序列表序列I的第289位至1020位所示的DNA分子；2)与I)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、 至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有 99%同源性且编码权利要求I或2所述蛋白质的DNA分子；3)在严格条件下与I)或2)限定的DNA序列杂交且编码权利要求I或2所述蛋白质的 DNA分子。
5.含有权利要求2或3所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒。
6.根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于所述重组载体为将权利要求3或4所述基因插入pET-32a(+)中得到表达权利要求I或2所述蛋白的重组载体。
7.根据权利要求6所述的重组载体，其特征在于所述重组载体为pET-32a(+)-HA，所述pET-32a (+) -HA是将序列表序列I的第289位至1020位所示基因连接到pET_32a (+)的多克隆位点处得到的重组载体。
8.根据权利要求7所述的重组载体，其特征在于所述pET-32a(+)-HA是将序列表序列I的第289位至1020位所示基因连接到pET-32a(+)的EcoR I位点处得到的重组载体。
9.根据权利要求5所述的重组菌，其特征在于所述重组菌为将权利要求5-8中任一所述重组载体导入大肠杆菌Rosetta-gamiB(DE3)中得到表达权利要求I或2所述蛋白的重组菌。
全文摘要
本发明公开了一种用于检测H5亚型禽流感病毒的重组HA蛋白及其编码基因。该蛋白是如下a)或b)的蛋白质a)由序列表序列2所示氨基酸序列组成的蛋白质；b)将序列表序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且可与H5亚型禽流感病毒的抗血清特异结合的蛋白。本发明所提供的蛋白是在不改变原有基因信息的前提下，通过选择HA基因中抗原表位集中、稀有密码子之间距离相对较远的区域作为目的基因进行表达，解决了HA全长基因在表达过程中由于部分区域存在密集分布的稀有密码子而导致目的蛋白表达产量低的难题，开拓了一条方便、低廉、高效获取检测抗原的途径。
文档编号C12N15/63GK102603874SQ20121008537
公开日2012年7月25日 申请日期2012年3月28日 优先权日2012年3月28日
发明者刘加波, 庞耀珊, 范晴, 谢丽基, 谢志勤, 谢芝勋, 邓显文 申请人:广西壮族自治区兽医研究所