专利名称：抗人大肠癌干细胞相关蛋白lyrm2的单克隆抗体及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种抗人大肠癌干细胞相关蛋白LYRM2的单克隆抗体，产生该抗体的杂交瘤细胞株及其制备与应用。 背景技术：
LYRM2基因定位于人类第6号染色体的长臂15区，在人类、猩猩、小鼠、犬、鸡、大鼠和斑马鱼中高度保守。这个基因包含4种转录产物，仅仅转录子I能翻译出结构蛋白，其他3种均因缺少翻译起始密码而不能启动翻译过程。LYRM2基因编码88个氨基酸，属于LYR复合体I超家族，这个家族被认为可能参与了真核细胞NADH复合体的组成,具体功能如何尚待研究。在我们的前期研究中，通过全基因组表达谱芯片比较结肠癌肝转移来源⑶133+细胞与⑶133-细胞，发现LYRM2在⑶133+细胞中高表达。⑶133作为干细胞一种重要的表面标记，已经在各种实体瘤中被广泛应用。但是关于LYRM2蛋白的结构和功能方面尚未见文献报道。为了进一步研究LYRM2基因及其蛋白在大肠癌干细胞中的作用，获得该蛋白的抗体成为当前的首要任务。
发明内容
本发明目的是提供一种抗人大肠癌干细胞相关蛋白LYRM2的单克隆抗体、杂交瘤细胞株及其制备与应用。本发明采用的技术方案是一种抗人LYRM2蛋白单克隆抗体，该抗体为IgGl亚类，由保藏号为CCTCC No:C201212的杂交瘤细胞株D0F8分泌产生。本发明还涉及所述的单克隆抗体的制备方法，所述方法包括(I)将核苷酸序列如SEQ ID No. I所示的人LYRM2基因插入原核表达载体pET-43. lb(+)中，构建重组载体，并将重组载体转化到宿主细菌E. coli.BL21(DE3)中，以含AMP50 μ g/mL的LB培养基于37°C下培养3h后，筛选宿主菌中高表达的阳性表达菌株作为工程菌，添加终浓度lmmol/L的IPTG于37°C下诱导3h，分离纯化(离心收集菌体，超声破碎后离心取上清经过镍柱进一步纯化)诱导液获得可溶性LYRM2融合蛋白，利用肠激酶酶切纯化即得氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示的可溶性LYRM2蛋白；具体方法如下从肠癌细胞系SW480提取总RNA，用RT-PCR方法得到SEQ ID NO. I所示核酸序列。扩增引物序列为上游引物为5' -GATGGCTGCTTCCCGCTT-3';下游引物为5' -GGACAGGTACCTTAAGATTTTGCTAAAGCAAG-3'。5'端引入PshA I酶切位点，3'端引入Kpn I酶切位点；所述原核表达载体为pET-43. lb(+)，整合了一个促溶解多肽Nus Tag序列，可增加LYRM2蛋白的可溶性避免包涵体的形成，同时可以通过该载体自带的His Tag利用Ni-NTA HisBind树脂进行纯化。此外，产物可以通过肠激酶将融合蛋白的Nus Tag部分切除而获得目的蛋白，并不会像非融合蛋白那样在N末端留下多余的氨基酸残基。因此，本发明利用该系统可获得高纯度的可溶性LYRM2蛋白。所述的表达宿主菌E. coli. BL21 (DE3)以T7RNA聚合酶为表达系统，可高效表达外源基因蛋白。SEQ ID NO. I 序列如下atggctgcttcccgcttacccccagcgacgctaacgttaaagcagttcgtaagaaggcaa 60
caagttcttctcctctacagaaggattttgcaaacaattcggcaagttccaaatgattct 120gatcgcaaatacctgaaagattgggcaagagaagaattcagaagaaacaaaagtgccacc 180gaagaggatacaatccggatgatgattactcaaggcaatatgcagctcaaggagttagaa 240aaaacacttgctttagcaaaatcttaa267SEQ ID NO. 2 序列如下Met Ala Ala Ser Arg Leu Pro Pro Ala Thr Leu Thr Leu Lys Gln151015Phe Val Arg Arg Gln Gln Val Leu Leu Leu Tyr Arg Arg He Leu202530Gln Thr He Arg Gln Val Pro Asn Asp Ser Asp Arg Lys Tyr Leu354045Lys Asp Trp Ala Arg Glu Glu Phe Arg Arg Asn Lys Ser Ala Thr505560Glu Glu Asp Thr He Arg Met Met He Thr Gln Gly Asn Met Gln657075Leu Lys Glu Leu Glu Lys Thr Leu Ala Leu Ala Lys Ser8085(2)用步骤(I)所得可溶性LYRM2蛋白免疫BALB/c小鼠，取免疫后的BALB/c小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合；(3)筛选融合后的细胞，获得可分泌抗人LYRM2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞，即得抗人LYRM2蛋白单克隆抗体。本发明还涉及一种能够产生前述抗人LYRM2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株D0F8，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国，武汉，武汉大学，邮编430074，保藏编号=CCTCC No C 201212，保藏日期2012 年 2 月 22 日。单克隆抗体的优点(I)杂交瘤可以在体外“永久”地存活并传代，只要不发生细胞株的基因突变，就可以不断的生产高特异性、高均一性的抗体。(2)可以用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗体。(3)由于可能得到“无限量”的均一性抗体，所以适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法，如IRMA和ELISA等。(4)由于单克隆抗体的高特异性和单一生物学功能，可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗。本发明的有益效果主要体现在本发明运用发酵工艺表达纯化大量稳定的重组可溶LYRM2融合蛋白，并利用肠激酶酶切和Ni柱分离纯化得到高纯度的LYRM2蛋白，将该蛋白免疫小鼠，获得的单克隆抗体特异性更高。本发明制备了检测大肠癌中LYRM2蛋白的单克隆抗体，填补了当前尚无抗人LYRM2单克隆抗体的空白，为临床诊断和实验研究提供了重要工具。
图I为LYRM2基因RT-PCR产物的电泳图；其中M为DNA分子量标记物，lOObp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp 为分子量大小；1 4 为 LYRM2 基因 RT-PCR 产物。图2为重组质粒pET43. Ib (+)-LYRM2诱导表达产物的电泳图；其中I 6为经IPTG诱导后重组质粒pET43. Ib (+) -LYRM2的表达情况；7为未经IPTG诱导后重组质粒pET43. Ib (+) -LYRM2的表达情况；M为蛋白分子量标记物，95KDa、72KDa、55KDa为蛋白分子量大小。图3为LYRM2融合蛋白在不同体系下经肠激酶酶切产物电泳图；其中，I :肠激酶2单位，融合蛋白17. 5μ8;2 :肠激酶2单位，融合蛋白35μ8;3 :肠激酶2单位，融合蛋白70 μ g ；4 :肠激酶2单位，融合蛋白105 μ g ；5 :肠激酶2单位，融合蛋白140 μ g ；6 :未经肠激酶酶切的融合蛋白；M为蛋白分子量标记物，72KDa、55KDa、43KDa、34KDa、26KDa、17KDa、IOKDa为蛋白分子量大小。图4为LYRM2融合蛋白大量酶切后纯化产物电泳图；其中I 3为融合蛋白肠激酶酶切后纯化产物；M 为蛋白分子量标记物，721(03、551(03、431(03、341(03、261(03、171(03、101(03
为蛋白分子量大小。图5为LYRM2蛋白Western blot鉴定图；其中I为未诱导产物上清；2为IPTG诱导表达LYRM2重组蛋白上清；3为重组LYRM2-E. coliBL21 (DE3)工程菌发酵纯化产物。图6为westernblot分析D0-F8抗LYRM2单克隆抗体特异性鉴定图；其中I 3 :一抗为单克隆抗体D0-F8(抗体稀释度分别为I : 1000，I 2000，I 5000)。图7为D0-F8、A9_G7抗LYRM2单克隆抗体的效价测定图；其中，横坐标为抗体稀释度，纵坐标为吸光值0D450， 为纯化后的单克隆抗体D0-F8。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此实施例I :制备重组可溶人LYRM2蛋白(1)LYRM2基因的克隆，表达载体的构建及鉴定根据GenBank中人LYRM2的基因序列(Genbank编号ΝΜ_020466· 4)。在其开放阅读框序列区的两侧设计一对引物，并在5'端引入PshA I酶切位点，3'端引入Kpn I酶切位点。上游引物为5'-GATGGCTGCTTCCCGCTT-3'；下游引物为5'-GGACAGGTACCTTAAGATTTTGCTAAAGCAAG-3'。从人大肠癌细胞系SW480 (ATCC)提取总RNA，经过RT-PCR扩增人LYRM2基因，凝胶电泳结果显示一大小约为260bp左右的单一片断，与目的片段(SEQ ID No. I)大小一致(参见图I)。使用限制性内切酶PshA I和Kpn I对PCR产物和质粒载体PET43. Ib (+)进行酶切，用T4连接酶将酶切产物与载体相连，转化DH5 α大肠杆菌感受态细菌，挑阳性菌落PCR进行初步鉴定。
(2)优化LYRM2蛋白在大肠杆菌内的诱导表达条件经DNA测序证实碱基和开放阅读框正确的阳性质粒，转化表达宿主菌E. cο I iBL21 (DE3)。优化LYRM2蛋白表达条件选取高表达LYRM2蛋白的单克隆菌落、IPTG诱导浓度、IPTG诱导时间和IPTG诱导温度优化。挑选10个单克隆菌落接种到7ml的LB培养基中，在37°C静置过夜。次日取菌液100 μ L加入到新的7ml的含AMP+(50 μ g/mL)的LB培养基中后在37°C 200rpm的摇床上摇3个小时左右，测细菌OD值为O. 6 O. 8时，并留ImL作为诱导前的对照，余下菌液加入终浓度O. I 4mmol/L IPTG于18 37°C摇床上再次摇 I 5小时。4°C 8000rpm离心IOmin收集菌体,用PBS清洗菌体一遍后再离心。用ImL的PBS悬浮菌体后在冰浴中进行超声裂解，超声15s间歇15s共5次，可见菌液变清亮。将裂解好的细菌在4°C 13000rpm离心30min，将诱导前及诱导后的沉淀与上清分别进行15%SDS-PAGE电泳后考马斯亮蓝染色分析目的蛋白(SEQ ID No. 2)表达情况。诱导后的菌在预测的分子量处有一条浓集的蛋白条带，诱导前的菌在相同的分子量处没有条带(参见图
2)。优化参数为培养温度37°C，培养时间3h ;诱导温度37°C，诱导时间3h ;诱导物IPTG终浓度为lmmol/L。(3)融合蛋白的大量制备按照小量培养的优化条件扩大培养。将-20 0C冻存的重组LYRM2-E. coliBL2KDE3)工程菌利用发酵罐发酵，发酵完成后，8000rpm IOmin离心收集菌体，并用O. 01mol/L的PBS将菌体洗涤两次，加适量PBS超声裂解，离心收集上清。O. 45 μ m滤器过滤发酵菌体裂解上清，Ni-S印roaseFF亲和柱上柱，以含lOOmmol/L咪唑缓冲液洗涤柱子后用含250mmol/L咪唑洗脱液进行洗脱.洗脱后SDS-PAGE电泳鉴定重组蛋白。用半透膜透析重组蛋白原液，分子量20000的PEG浓缩重组蛋白。用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。(4)重组肠激酶酶切融合蛋白，获得目的蛋白利用重组肠激酶小量酶切融合蛋白，优化酶切条件，酶切产物用Novagen公司NI-NAT柱纯化目的蛋白，因LYRM2蛋白(SEQ ID No. 2)不含有His标签，洗脱液中即为目的蛋白。15%SDS-PAGE电泳后考马斯亮蓝染色分析目的蛋白产量和纯度(参见图3)，根据优化条件大量酶切LYRM2融合蛋白，然后利用NI-NAT柱纯化LYRM2蛋白，15% SDS-PAGE电泳后考马斯亮蓝染色分析目的蛋白产量和纯度(参见图4)。(5)Western Blot鉴定重组蛋白抗原性通过His抗体检测其原核表达载体的His标签，且酶切之后的LYRM2蛋白不含His标签，故对重组LYRM2-E. coli BL21(DE3)工程菌发酵纯化产物、诱导产物、未诱导产物上清进行Western blot分析。可见，重组LYRM2-E. coli BL21(DE3)工程菌发酵纯化产物和IPTG诱导产物均在72000处出现目的条带，而未诱导产物上清未见条带出现，与预期相符(参见图5)。实施例2 LYRM2单克隆抗体的制备及鉴定(I)免疫BALB/c小鼠取8周龄雌性BALB/c小鼠5只腹腔注射LYRM2蛋白进行免疫，共进行3次免疫。每次每只小鼠免疫抗原用量为100 μ g/只。第3次免疫后7d眼球采血，间接ELISA法测抗体效价。融合前3d，用PBS稀释100 μ g LYRM2蛋白加强免疫。(2)细胞融合骨髓瘤细胞SP2/0-Ag_14(ATCC)和小鼠脾脏细胞按I : 5的比例混合加至预热40°C的50%聚乙二醇(PEG)，作用90s。然后加入5mLHAT培养基，种96孔板每孔100μ L，37°C、5% CO2培养箱内培养。(3)杂交瘤细胞的筛选及克隆细胞融合14天后，待杂交瘤细胞集落可见时用间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞孔，立即用有限稀释法进行克隆化。检测为阳性的杂交瘤细胞按有限稀释法进行亚克隆I 2次，挑选反应较强的克隆细胞扩大培养作为建株细胞，直液氣中保存。(4)克隆抗体的制备及纯化取10周龄BALB/c小鼠腹腔注射O. 2mL液体石蜡IOd后每只小鼠腹腔注射经PBS洗涤的杂交瘤细胞悬液O. 3mL约I X IO6个细胞待小鼠腹水积聚后无菌采集腹水1500r/min离心IOmin去除红细胞等杂质分装后_70°C保存备用。收集的上清液经HiTrapProtein G HP的柱子进行IgG抗体的纯化首先用20mL 50mmol/L的PBS(pH7. 4)洗柱，流速为80mL/h，然后用注射器以40mL/h的速度加入20mL单抗上清然后用30mL 50mmol/L的PBS (pH7. 4)洗柱，流速为60mL/h,最后用2 5倍柱体积的O. 2mol/L的Glycine-HCl (pH3. O)洗脱,用收集管分管收集洗脱液。(5)单克隆抗体的初步鉴定鼠IgG亚型分析^mAb亚类试剂盒说明书利用ELISA检测鼠单克隆抗体的IgG亚型，可见D0F8单克隆抗体为IgGl (参见表I)。表I :D0F8鼠单克隆抗体亚型分析
权利要求
1.一种抗人LYRM2蛋白单克隆抗体，由保藏号为CCTCC No C 201212的杂交瘤细胞株D0F8分泌产生。
2.如权利要求I所述的单克隆抗体的制备方法，所述方法包括 (1)将核苷酸序列如SEQID No. I所示的人LYRM2基因插入原核表达载体pET-43. lb(+)中，构建重组载体，并将重组载体转化到宿主细菌E. coli.BL21(DE3)中，以含AMP 50 u g/mL的LB培养基于37°C下培养3h后，筛选阳性克隆添加终浓度lmmol/L的IPTG于37°C下诱导3h，分离纯化诱导液获得可溶性LYRM2融合蛋白，利用肠激酶酶切纯化即得氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示的可溶性LYRM2蛋白； (2)用可溶性LYRM2蛋白免疫BALB/c小鼠，取免疫后的BALB/c小鼠的脾细胞与SP2/0 骨髓瘤细胞融合； (3)筛选融合后的细胞，获得可分泌抗人LYRM2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞，即得抗人LYRM2蛋白单克隆抗体。
3.如权利要求I所述的单克隆抗体在制备人LYRM2表达情况的免疫检测试剂盒中的应用。
4.杂交瘤细胞株D0F8，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国，武汉，武汉大学，邮编430074，保藏编号CCTCC No C 201212，保藏日期2012年2月22日。
全文摘要
本发明提供了一种抗人大肠癌干细胞相关蛋白LYRM2的单克隆抗体、杂交瘤细胞株及其制备与应用，该抗体为IgG1亚类，由保藏号为CCTCC NoC201212的杂交瘤细胞株D0F8分泌产生。本发明运用发酵工艺表达纯化大量稳定的重组可溶LYRM2融合蛋白，并利用肠激酶酶切和Ni柱分离纯化得到高纯度的LYRM2蛋白。用该蛋白免疫Bal-B/C小鼠，并将骨髓瘤细胞SP2/02Ag14与小鼠脾脏细胞融合获得杂交瘤细胞，筛选融合后的细胞获得了可分泌抗人LYRM2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞，进而制备了检测大肠癌中LYRM2蛋白的单克隆抗体及，填补了当前尚无抗人LYRM2单克隆抗体的空白，为临床诊断和实验研究提供了重要工具。
文档编号C12N15/70GK102627697SQ20121010761
公开日2012年8月8日 申请日期2012年4月12日 优先权日2012年4月12日
发明者叶俊, 朱永良, 武当, 陈志刚, 黄建 申请人:浙江大学