专利名称：一种青鳉鱼卵巢结构蛋白基因启动子及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及动物基因工程技术，特别涉及一种来自青鏘鱼卵巢结构蛋白(OSPl)基因启动子序列的克隆及其基础上建立的的转基因青鏘鱼在特异性地指示雌激素类物质暴露下的鱼类雌性 同体发生中的应用。
背景技术：
环境雌激素类物质如一些天然的和人工合成的雌激素，部分杀虫剂，除草剂等已经被证明能够在低浓度下造成鱼类性腺发育迟缓，精巢退化以及雌雄同体现象的发生(Gimeno et al. Aquat Toxicol 43:93-109. ；Papoulias et al. Environ Health Perspect111 :29-32. ；Kidd et al. Proc Natl Acad Sci U. S. A. 104 :8897-8901.)。尤其是鱼类雌雄同体现象能够在各种淡水和海洋生态系统中观测到，已经成为指示野生鱼类雌性化的一个明确指标(Jobling et al. Environ Sci Technol 32 :2498-2506. ；Hinck et al. AquatToxicol 95 :60-70.)。如在英国部分河流和湖泊中的欧鲤种群雌雄同体发生率甚至能够达至Ij 100% (Jobling et al. 1998)。雄鱼中严重雌雄同体现象能够通过影响精子质量,受精率和孵化率等方式降低鱼类的繁殖能力，进而进一步影响到鱼类的种群平衡(Jobling etal.Biol Reprod 67 :515-524. ；ffilliams et al. Environ Toxicol Chem 28:220-230. ；Anet al. Environ. Sci. Technol. 2009,43 (20)，7895-901.)。因此，评估鱼类雌雄同体发生的合适方法不仅对理解雌雄同体的发生机理以及雌雄同体发生的生态毒理学效应有着非常重要的意义而且还可以应用于化学品的环境管理。目前，评估鱼类雌雄同体的发生主要是依靠组织切片观察的方法，但是这种方法耗时耗力，需要娴熟的技术，花费十分昂贵，而且往往只能观察到性腺的几个侧面，做不到准确全面的评价整个性腺的雌雄同体发生情况(Lin et al. Ecotox Environ Safe 72:286-292.)。这大大限制了对人们对鱼类雌雄同体发生的理解。目前国际上并没有灵敏，简便，准确的实验方法用来监测鱼类的雌雄同体。
发明内容
本发明的目的在于提供一种青鏘鱼卵巢结构蛋白(0SP1)基因启动子，并在此基础上构建起0SP1P-GFP转基因青鏘鱼，用来特异性指示鱼类雌雄同体发生的发生率和发生程度。本发明所提供的雌激素诱导的鱼卵巢结构蛋白基因启动子，来源于模式物种青鏘鱼(Oryzias Iatipes),具有序列表SEQ ID No : I所示的核苷酸序列。序列表中的SEQ ID No :1由2064个碱基组成。含有本发明启动子的表达载体和宿主菌均属于本发明的保护范围。本发明通过PCR技术克隆出OSPl基因启动子，序列如SEQ ID No 1所示。将此启动子连接到PEGFP-I质粒中的绿色荧光蛋白基因上游区域，用显微注射的方式将融合质粒注射到青鏘鱼受精卵中，构建出转基因青鏘鱼。
本发明构建的转基因鱼能准确，快速，灵敏地指示外源性内分泌干扰物质暴露下造成的青鏘鱼雌雄同体的发生率和发生程度，能够应用于雌激素效应物质的快速筛选和环境中雌激素效应物质的检测。下面通过实施例，结合附图对本发明做进一步详细描述，但不以任何方式限制本发明的范围。
图I.以OSPl基因启动子为基础构建的转基因青鏘鱼雌鱼中绿色荧光蛋白表达的观察。A :活体观察绿色荧光蛋白在青鏘鱼卵巢中的表达；B :通过冰冻鱼体，摄取性腺观察绿色荧光蛋白在青鏘鱼卵巢中的表达。
图2.雌雄同体雄鱼性腺中绿色荧光蛋白表达的观察。A :未发生雌雄同体的雄鱼性腺；B_D :在不同雌雄同体发生程度的鱼性腺中的绿色荧光蛋白表达。
具体实施例方式I.基因组DNA提取A.剪取成熟雌性青鏘鱼性腺置于Iml Trizol试剂中研磨，直至溶液呈匀浆状态。B.在匀浆液中加入200μ I三氯甲烷，混匀，离心，12000rpm，4°C，15min。C.去除离心上清液后，在离心管中加入400 μ I DNA提取缓冲液，55°C温浴lOmin。混勻，离心，12000rpm, 4°C，15min。D.取上清液，加入Iml无水乙醇，混匀，离心，12000rpm，4°C，10min。E.去除上清液，加入Iml 75% DEPC酒精洗沉淀，离心，7500rpm，4°C，5min。F.去除上清液，将沉淀略晾干，溶于200ml pH ^ 8. O的DEPC水中，获得基因组DNA。2. OSPl基因启动子的克隆A.根据http://www. ensembl. org/搜索OSPl基因上游部分DNA编码序列。B.设计克隆OSPl基因启动子所需引物正向primer-F 5，-CGGGGTACCTTCAACTTGTGTGGGGTAGATGT-3 ’反向primer-R 5，-TCCCCCCGGGTCTGCTGGTTGCTATTGACTGAT-3，primer-F 和 primer-R 中，序列 GGTACC 为 Kpnl 酶切位点，序列 CCCGGG 为 Xmal 酶切位点。C.利用PCR技术扩增相应DNA片段，PCR反应体系为基因组DNA0.5 μ
dNTP2 μ
10XPCR buffer2.5 μ
primer-F0.5 μ!
primer-R0.5 μ
rTaq DNA 聚合酶0.125 μ
ddH2018.875 μ PCR 反应条件为:94 °C，3min ； (94 °C，35s ；60 °C，35s ；72 °C, 3min ；36cycles)； 72。。，IOmin。D.将调取的DNA片段正反向测序验证，测序得SEQ ID No 1所示序列。3. OSPIP-GFP融合质粒的构建A.将调取的带酶切位点的启动子区序列双酶切，酶切体系为
Kpn I0.5 ‘LU
XrnaI0.5 μ I
NEBuffer 42 μ
BSA0.2 μ
ddH201.8 μ
DNA15 μ
37°C温浴 3h。B.将PEGFP-I质粒双酶切，酶切条件
Kpn l0.5 μ
Xma I0.5 μ
NEBuffer 42 μ
BSA0.2 μ I
ddH206.8 μ
DNA10 μ 37nC温浴 3h。C.将酶切后的DNA片段和PEGFP-I质粒连接。连接条件
权利要求
1.一种青鎌鱼卵巢结构蛋白基因启动子，具有序列表中SEQ ID No :1所不的核昔酸序列。
2.如权利要求I所述的启动子，其特征在于，所述青鏘鱼卵巢结构蛋白基因是OSPl基因的cDNA序列或基因组DNA序列。
3.含有权利要求I所述的启动子的重组质粒载体或宿主菌。
4.由权利要求I所述的启动子构建转基因鱼的方法，其特征在于将所述启动子的重组质粒载体注射到青鏘鱼受精卵细胞中，经过孟德尔遗传规律筛选，培养得到纯合子转基因鱼。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，将所述启动子连接到PEGFP-I质粒中的绿色荧光蛋白基因上游区域，形成0SP1P-GFP重组质粒。
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述重组质粒载体通过显微注射的方式注射到青鏘鱼受精卵细胞中。
7.由权利要求3或4所述启动子构建的转基因鱼在指示转基因鱼雌雄同体发生率和发生程度的应用。
全文摘要
本发明公开了一种青鳉鱼卵巢结构蛋白(OSP1)基因启动子及其应用。将所述启动子连接到PEGFP-1质粒中的绿色荧光蛋白基因上游区域，用显微注射的方式将融合质粒注射到青鳉鱼受精卵中，构建得到转基因青鳉鱼，其能准确，快速，灵敏地指示外源性内分泌干扰物质暴露下造成的青鳉鱼雌雄同体的发生率和发生程度，能够应用于雌激素类物质的快速筛选和环境中雌激素效应物质的检测。
文档编号C12R1/19GK102936596SQ201210304159
公开日2013年2月20日 申请日期2012年8月23日 优先权日2012年8月23日
发明者胡建英, 赵砚彬, 夏爽, 蒋洁琼 申请人:北京大学