专利名称：一种调控cyp基因表达水平的方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种调控非人类哺乳动物体内CYP450基因表达水平的方法以及，该方法在制备产生非人类哺乳动物模型系统中的应用；进一步的，本发明涉及利用该方法产生的动物模型系统，以及动物模型系统在医学、药理学、临床前药物研究、药品开发、实验动物模型系统制备、疾病诊断或疾病治疗方法研究中的应用，尤其是临床前药物研究中的应用。
背景技术：
细胞色素P450 (Cytochrome P450,或简称CYP或P450)是一个亚铁血红素-硫醇盐蛋白超家族，人类具有55个功能基因和29个假基因；根据基因序列的同源性，该基因超家族可被进一步分为17个基因家族和42个亚家族。在细胞中，CYP蛋白主要分布在内质网和线粒体内膜上，作为一种末端加氧酶，参与了生物体内主要的内源性物质和外源物质的代谢过程，包括留醇类激素的合成、药物代谢等。CYP1A2与临床药物代谢下面以CYP1A2为例，说明CYP基因家族在临床药物代谢中的作用。CYP1A2是一种由多环芳香烃诱导的CYP亚型，主要在肝脏表达，人类肝脏中CYP1A2基因的表达量约占总CYP蛋白量的13%。在不同个体中，CYP1A2基因的表达水平差异较大，并且受非遗传因素的影响，同时还具有明显的种族及性别差异。CYP1A2主要参与咖啡因、非那西丁、醋氨酚、17 0-雌二醇、普洛萘尔、维拉帕米、硝苯地平、丙咪嗪等20余种药物的代谢，并在十余种前致癌物的激活或灭活中发挥重要的作用。研究表明，CYP1A2基因生理活性的高低与药物的疗效、毒性以及某些肿瘤的易感性密切相关。CYP酶与药物不良反应临床治疗中，绝大多数患者都存在多药并用的情况，因为药物间的相互作用导致的不良反应也呈逐年上升趋势，这已成为医疗实践中一个亟待解决的问题。据世界卫生组织药物不良反应协作中心报告，1986至1996年十年间，由第二代抗组织胺药造成的不良反应死亡报告就多达100多例，发生机制正是由于药物间的相互作用导致患者严重心律失常。美国的一项研究结果表明，住院患者中严重药物不良反应的发生率为6.7%，致死性药物不良反应的发生率为0.32%，因药物相互作用导致的致死率已排名住院患者死亡原因的第四至第五位。不仅如此，药物不良反应导致美国FDA在1980-1998年之间，将13种批准上市的新药从市场上撤出。过去由于对药物间相互作用的认识不够，通常其咎于患者的个体差异，没有给予充分的重视。随着生物技术的发展，人们逐渐认识到药物间的相互作用以及由此导致的不良反应与CYP基因家族的功能密切相关。研究表明，CYP与药物分子的结合和催化能力与药物的结构特征相关，即使是同一类药品，它们的酶学基础也可能存在差异，这就对CYP在药物代谢中作用的研究提出了更高的要求。CYP酶与药物代谢及药物临床研究美国最近公布的一项调查报告指出，临床药物研究过程中只有大约10%的候选药物可最终进入市场，大约40%的候选药物是由于无体内活性或药代动力学参数不佳而 被淘汰。通常情况下，新药研究的过程一般可分为药物设计和新药开发两个阶段。在药物开发阶段，需要对候选物进行代谢、毒性及药效评估，药物代谢研究、尤其是CYP超家族在药物代谢中作用的研究是其中的一个重要方面。在研究开发的早期，首先利用各种体外模型对候选物的代谢特性(参与代谢酶的种类，活性代谢物的生成，对CYP酶的诱导、抑制等)进行高通量分析，确定药物是否有继续开发的价值；然后利用实验动物模型对药物的体内代谢进行研究，根据研究结果推断药物在人体内的生物转化模式。体外研究模型目前主要有CYP cDNA体外表达的代谢酶、体外培养的H印G2、Caco-2和HT29-18-C1细胞株、肝微粒体、肝细胞悬液、以及肝切片等。因其简便易行，这些体外模型被广泛地应用于新药开发的各个阶段。一般认为，由体外模型研究鉴定的药物代谢特征可在一定程度上反映药物的体内代谢情况；但与体内复杂的代谢环境和过程相比，体外模型研究存在明显的技术不足，比如在体内代谢中，一种药物的代谢过程通常可以被多种同工酶或不同酶系统催化调节；而一种CYP通常又可以催化多种药物的体内代谢。这种药物体内代谢反应的复杂性源于药物代谢酶系统的多样性，因此需要在更高的体系层面上对其进行研究，尤其是整体动物水平。在体药物代谢模型在药物临床前研究中，不仅要对药物的体外代谢、药效、效应机制等方面进行研究，还需要选定合适的动物种类进行药物代谢的体内实验。进一步的，FDA从1998年开始要求新药申报时尽量提供药物体内相互作用的研究资料，期望能够减少因严重的体内相互作用导致上市药物被淘汰的风险，保证患者的用药安全。其中一个重要的方面就是研究CYP基因家族成员在药物代谢过程中的作用。除了利用野生型动物进行这些研究以外，研究人员还进一步建立了若干CYP代谢酶基因敲除和人源化转基因小鼠动物模型，使得能够在尽可能模拟人体复杂环境的生物体系中开展药物代谢研究。药物代谢研究中的问题及解决方案与野生型动物相比，转基因动物模型的建立为CYP研究提供了一个更优化的技术方案，但因其周期长、费用高、以及基因功能代偿等原因，使得该项技术的应用还非常有限。在药物代谢常用的大动物模型，如犬、猴等动物中，转基因技术尚不成熟。为了从根本上解决药物研发中的这个问题，本发明将在体RNA干扰技术或基因工程过表达技术应用于药物代谢研究，利用体内递送系统将能够抑制某种CYP基因表达的寡聚核酸分子(siRNA、miRNA或其类似物)或其表达载体、能够表达某种CYP基因的表达载体导入非人类哺乳动物体内，降低或提高目的CYP在动物体内的表达水平，从而研究目的CYP在药物代谢中的作用。
发明内容
本发明涉及以下按顺序编号的段落中定义的主题:1、一种在非人类哺乳动物体内操纵细胞色素P450 (CYP)基因表达水平的方法，包括以下步骤:I)获得一种能够抑制目的CYP基因表达的寡聚核酸分子、或一种能够产生抑制目的CYP基因表达的寡聚核酸分子的表达载体、或一种能够表达目的CYP基因的表达载体；2)将步骤I中的寡聚核酸分子或表达载体与体内递送载体接触；
3)将步骤2中的核酸分子-体内递送载体复合物导入所述非人类哺乳动物体内。2、根据段落I所述的方法，其特征在于所述体内递送载体为非病毒体内递送载体，该方法包括以下步骤:I)获得一种能够抑制目的CYP基因表达的寡聚核酸分子、或一种能够产生抑制目的CYP基因表达的寡聚核酸分子的表达载体、或一种能够表达目的CYP基因的表达载体；2)将步骤I中的寡聚核酸分子或表达载体与所述非病毒体内递送载体接触，形成复合物；3)将步骤2中形成的复合物导入所述非人类哺乳动物体内；4)检测目的CYP基因在步骤3)获得的非人类哺乳动物体内的表达水平。3、根据段落I或2所述的方法，其特征在于同时操纵两种或两种以上CYP基因在非人类哺乳动物体内的表达水平。4、根据段落I或2所述的方法，其特征在于所述非人类哺乳动物选自小鼠、大鼠、狗、猪、或猴；优选为小鼠、大鼠、狗或猴。5、根据段落I或2所述的方法，其特征在于所述能够表达目的CYP基因的表达载体为包含目的CYP基因的全部或部分基因组序列的真核细胞表达载体。6、根据段落I或2所述的方法，其特征在于所述能够表达目的CYP基因的表达载体为包含目的CYP基因的全部或部分转录本序列的真核细胞表达载体。7、根据段落I或2所述的方法，其特征在于所述能够抑制目的CYP基因表达的寡聚核酸分子为小干扰核酸分子。8、根据段落7所述的方法，其特征在于所述小干扰核酸分子为化学修饰的小干扰核酸分子。9、根据段落8所述的方法，其特征在于所述化学修饰选自以下修饰方式中的一种或几种:(I)对核苷酸中核糖的化学修饰；(2)对核苷酸中碱基的化学修饰；(3)对核苷酸之间磷酸二酯键的化学修饰。10、根据段落9所述的方法，其特征在于所述化学修饰为对核苷酸中核糖2’_0H的修饰。11、根据段落10所述的方法，其特征在于所述化学修饰为核苷酸中核糖2’ -OH被甲氧基或氟取代。12、根据段落9所述的方法，其特征在于所述化学修饰为核苷酸之间的磷酸二酯键被硫代憐Ife酷键取代。13、根据段落9所述的方法，其特征在于所述化学修饰为核苷酸的碱基被非RNA碱基取代。14、根据段落13所述的方法，其特征在于所述非RNA碱基选自胸腺嘧唳(thymine)、5_甲基胞卩密卩定(5-methylcytosine)、异胞卩密卩定(isocytosine)、假异胞卩密唳(pseudoisocytosine)、5_溴尿卩密卩定(5-bromouracil)、5_丙块基尿卩密唳(5-propynyluracil)、5_ 丙块基-6-氟代尿卩密卩定(5-propyny-6_f Iuoroluracil)、5-甲基噻唑尿卩密 P定(5 -methylthiazoIeuraci I)、6_ 氨基嘌呤(6-aminopurine)、2-氨基嘌呤(2-aminopurine)、肌苷(inosine) >2,6- 二氨基嘌呤(2,6-diaminopurine)、7-丙炔基-7-脱氮腺嘌呤(7-propyne-7_deazaadenine)、7_丙炔基_7_脱氮鸟嘌呤(7-propyne-7-deazaguanine)、2-氯 _6_ 氨基嘌呤(2-chloro-6_aminopurine)。15、根据段落13所述的方法，其特征在于所述化学修饰为核苷酸的碱基被DNA碱基取代。16、根据段落7-15任一项所述的方法，其特征在于所述小干扰核酸分子至少一端与胆固醇或PEG连接。17、根据段落I或2所述的方法，其特征在于所述能够抑制目的CYP基因表达的寡聚核酸分子选自反义核酸、microRNA、microRNA类似物或microRNA抑制物。18、根据段落I或2所述的方法，其特征在于所述能够产生抑制目的CYP基因表达的寡聚核酸分子的表达载体为shRNA表达载体。19、根据段落I或2所述的方法，其特征在于所述体内递送载体选自脂质体、高分子聚合物、多肽、纳米颗粒。 20、根据段落I或2所述的方法，其特征在于所述体内递送载体为肝靶向递送载体。21、根据段落I或2所述的方法，其特征在于所述将混合物导入非人类哺乳动物体内的方法为静脉注射。22、根据段落I或2所述的方法，其特征在于所述检测目的CYP基因表达水平的方法选自实时突光定量PCR(RT-PCR)、Taqman PCR、Northern杂交或Western杂交。23、段落1-21任一项所述的方法在制备CYP基因过表达或者表达抑制的非人类哺乳动物模型系统中的应用。24、段落1-21任一项所述的方法制备的非人类哺乳动物模型系统。25、段落1-21任一项所述的方法在医学、药理学、临床前药物研究、口服药物的代谢研究、静脉注射药物的代谢研究、药品开发、实验动物模型系统制备、疾病诊断或疾病治疗方法研究中的应用。26、根据段落I所述的方法，其特征在于所述体内递送载体为病毒载体，该方法包括以下步骤:I)获得一种能够产生抑制目的CYP基因表达的寡聚核酸分子的病毒表达载体、或一种能够表达目的CYP基因的病毒表达载体；2)对步骤I中的病毒表达载体进行包装，获得病毒；3)将步骤2中获得的病毒导入所述非人类哺乳动物体内；4)检测目的CYP基因在所述非人类哺乳动物体内的表达水平。27、根据段落26所述的方法，其特征在于所述病毒表达载体选自腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、或单纯疱疫病毒载体。28、段落26或27任一项所述的方法在制备CYP基因过表达或者表达抑制的非人类哺乳动物模型系统中的应用。29、段落26或27任一项所述的方法制备的非人类哺乳动物模型系统。30、段落26或27任一项所述的方法在医学、药理学、临床前药物研究、口服药物的代谢研究、静脉注射药物的代谢研究、药品开发、实验动物模型系统制备、疾病诊断或疾病治疗方法研究中的应用。31、一种分离的细胞色素P450基因小干扰核酸分子靶序列，其中所述靶序列为细胞色素P450基因的mRNA(cDNA)上任意连续17-30个核苷酸序列。32、根据段落31所述的靶序列，其中所述靶序列为表14和表15中任意一条序列。33、一种小干扰核酸分子，其指导细胞中细胞色素P450基因mRNA序列的剪切，从而实现对P450表达的抑制，该小干扰核酸分子包含与选自表14或表15中任意一条序列互补的序列。34、段落33所述的小干扰核酸分子，其特征在于所述小干扰核酸分子为化学修饰的小干扰核酸分子。35、段落34所述的小干扰核酸分子，其特征在于所述化学修饰选自以下修饰方式中的一种或几种:(I)对核苷酸中核糖的化学修饰；(2)对核苷酸中碱基的化学修饰；(3)对核苷酸之间磷酸二酯键的化学修饰。36、段落35所述的小干扰核酸分子，其特征在于所述化学修饰为对核苷酸中核糖2’ -OH的修饰。37、段落36所述的小干扰核酸分子，其特征在于所述化学修饰为核苷酸中核糖2’ -OH被甲氧基或氟取代。38、段落35所述的小干扰核酸分子，其特征在于所述化学修饰为核苷酸之间的磷酸二酯键被硫代磷酸酯键取代。39、段落35所述的小干扰核酸分子，其特征在于所述化学修饰为核苷酸的碱基被非RNA碱基取代。40、段落39所述的小干扰核酸分子，其特征在于所述非RNA碱基选自胸腺11密唳(thymine)、5_ 甲基胞卩密唳(5-methylcytosine) > 异胞卩密卩定(isocytosine) >假异胞卩密唳(pseudoisocytosine)、5_溴尿卩密卩定(5-bromouracil)、5_丙块基尿喃唳(5-propynyluracil)、5-丙块基-6-氟代尿卩密唳(5-propyny-6-fIuoroluracil)、5-甲基噻唑尿卩密 P定(5-methylthiazoIeuraciI)、6_ 氨基嘌呤(6-aminopurine)、2-氨基嘌呤(2-aminopurine)、肌苷(inosine) >2,6- 二氨基嘌呤(2,6-diaminopurine)、7-丙炔基-7-脱氮腺嘌呤(7-propyne-7_deazaadenine)、7_丙炔基_7_脱氮鸟嘌呤(7-propyne-7-deazaguanine)、2-氯 _6_ 氨基嘌呤(2-chloro-6_aminopurine)。41、段落39所述的小干扰核酸分子，其特征在于所述化学修饰为核苷酸的碱基被DNA碱基取代。42、段落33-41任一项所述的小干扰核酸分子，其特征在于所述小干扰核酸分子至少一端与胆固醇或PEG连接。43、一种抑制细胞色素P450基因表达的小干扰核酸分子组合物，其特征在于包括段落33-41任一项所述的至少一种小 干扰核酸分子和至少一体内递送载体。44、根据段落43所述的小干扰核酸分子组合物，其特征在于所述体内递送载体选自脂质体、高分子聚合物、多肽、纳米颗粒。45、根据段落43所述的小干扰核酸分子组合物，其特征在于所述体内递送载体为肝靶向递送载体。46、段落42-45任一项所述的小干扰核酸分子或组合物在制备CYP基因表达抑制的非人类哺乳动物模型系统中的应用。47、段落42-45任一项所述的小干扰核酸分子或组合物在医学、药理学、临床前药物研究、口服药物的代谢研究、静脉注射药物的代谢研究、药品开发、实验动物模型系统制备、疾病诊断或疾病治疗方法研究中的应用。本发明提供了一种可用于药物临床前研究的技术方案及体系，使得能够在尽可能模拟人体复杂环境的生物体系中开展药物代谢研究。本发明提供了一种在非人类哺乳动物体内操纵CYP基因表达水平的方法，包括以下步骤:1)获得一种能够抑制目的CYP基因表达的寡聚核酸分子、或一种能够产生抑制目的CYP基因表达的寡聚核酸分子的表达载体、或一种能够表达目的CYP基因的表达载体；2)将步骤I中的寡聚核酸分子或表达载体与递送系统接触，形成混合物；3)将步骤2中的混合物导入所述非人类哺乳动物体内；4)检测目的CYP基因在步骤3)获得的非人类哺乳动物体内的表达水平。本发明中所述的CYP基因包括但不限于所述动物体内源性和外源性的CYP基因；优选的，本发明所述的CYP基因为人类来源的CYP基因。一方面，本发明提供了一种用于操纵非人类哺乳动物体内CYP基因表达水平的方法，所述的哺乳动物优选为常用的模型动物；更优选的，本发明提供了一种在常用于药物临床前代谢研究的非人类哺乳动物体内操纵CYP基因表达水平的方法；更优选的，本发明提供了一种在小鼠、大鼠、狗、猪或猴体内操纵CYP基因表达水平的方法。—方面，本发明提供了一种在非人类哺乳动物体内操纵CYP基因表达水平的方法，所述CYP基因是细胞色素P450 (Cytochrome P450)基因超家族中的一个或几个成员。优选的，所述CYP基因包括但不限于以下基因:l，lA，la，lAl，lal，lA2，la2，lA4，1A5,1A8P, IB, lb, 1B1, lbl, 1C1,1C2,1D1，1D1P，2，2A，2a，2al，2a2，2a3，2a4，2a5，2A6，2A7，2A7PC,2A7PT,2A8，2A9，2A10，2A11，2al2，2A13，2A18PC，2A18PN,2A19，2a21，2a22，2A23，2A24,2A25,2B,2b,2bl,2b2,2b3,2B6,2B7P,2B8,2b9,2bl0，2B11，2B12，2bl3，2B14，2B15,2B16P,2B17，2bl8，2bl9,2b20,2b21，2B22，2b23,2b24,2B25,2b26,2b27,2b28,2b29, 2B30,2b31，2C，2c，2Cl，2C10，2cll，2cl2，2cl3，2C14，2C15，2C16，2C18，2C19，2C2，2C20，2C21，2c22, 2c23,2c24,2C25,2C26,2C27,2C28,2c29,2C3,2C30,2C31,2C32,2C33,2C34,2C35,2C36,2c37,2C37,2c38,2c39,2C4,2c40,2C41,2C42,2C42P1,2c44,2C49，2C5，2c50，2c51，2c52ps,2c53ps,2c54,2c55,2C58P,2c6,2C6P,2C62P,2c65,2c66,2c67,2c68,2c69,2c7,2c70，2c71ps，2c72ps，2c73ps，2c77，2c79，2C8，2C9，2D，2d，2Dl，2dl0，2dll，2dl2，2dl3，2D14,2D15,2D16,2D17,2dl8,2d2,2D20,2D21,2d22,2D23,2D24,2D25,2d26,2d3,2d32ps,2d33ps,2d34,2d35,2d36,2d37,2d38,2d39,2d4,2d40,2d41,2d5,2D6,2D7AP,2D7P,2D8BP,2D8P,2d9,2E,2e,2E1，2el，2E2，2F,2f,2F1，2F1P，2f2,2f4,2G,2g,2gl，2G1P，2G2, 2G2P, 2H,2h，2Hl，2H2，2J，2j，2J2，2j3，2J3Pl，2j4，2j5，2j5ps，2j6，2j7，2j8，2j9，2jl0，2jll，2jl2，2jl3,2jl4ps,2jl5ps,2jl6,2j17ps,2j18ps,2J19,2J20,2J21，2J22，2J23,2J24P,2J32,2J33,2J34,2J35,2K,2k,2K6,2K7,2K8,2K16,2K17，2K18，2K19，2K20，2K21，2K22,2K31，2N,2n，2N13，2P，2p，2P6，2P7，2P8，2P10，2P14，2P15P，2R，2r，2Rl，2rl，2S，2s，2Sl，2sl，2T，2t,2tl,2T2,2T2P,2T3P,2t4,2U,2u,2Ul, 2ul,2ff,2w,2ffl,2wl,2X,2x,2X6，2X7，2X8，2X9，2X10,2X11,2Y,2y,2Y3,2Y4,2AA,2aa,2AA1，2AA2，2AA3，2AA4，2AA6,2AA7,2AA8,2AA9,2AA9,
权利要求
1.一种在非人类哺乳动物体内操纵细胞色素P450 (CYP)基因表达水平的方法，包括以下步骤: 1)获得一种能够抑制目的CYP基因表达的寡聚核酸分子、或一种能够产生抑制目的CYP基因表达的寡聚核酸分子的表达载体、或一种能够表达目的CYP基因的表达载体； 2)将步骤I中的寡聚核酸分子或表达载体与体内递送载体接触； 3)将步骤2中的核酸分子-体内递送载体复合物导入所述非人类哺乳动物体内。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述体内递送载体为非病毒体内递送载体，该方法包括以下步骤: 1)获得一种能够抑制目的CYP基因表达的寡聚核酸分子、或一种能够产生抑制目的CYP基因表达的寡聚核酸分子的表达载体、或一种能够表达目的CYP基因的表达载体； 2)将步骤I中的寡聚核酸分子或表达载体与所述非病毒体内递送载体接触，形成复合物； 3)将步骤2中形成的复合物导入所述非人类哺乳动物体内； 4)检测目的CYP基因在步骤3)获得的非人类哺乳动物体内的表达水平。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述能够抑制目的CYP基因表达的寡聚核酸分子为小干扰核酸分子。
4.一种分离的细胞色素P450基因小干扰核酸分子靶序列，其中所述靶序列为细胞色素P450基因的mRNA(cDNA)上任意连续17-30个核苷酸序列；优选为表14和表15中所列的任意一条序列。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述体内递送载体选自脂质体、高分子聚合物、多肽、纳米颗粒；优选为肝靶向递送载体。
6.一种抑制细胞色素P450基因表达的小干扰核酸分子组合物，其特征在于包括权利要求3-5任一项所述的至少一种小干扰核酸分子和至少一体内递送载体。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述体内递送载体为病毒载体，该方法包括以下步骤: 1)获得一种能够产生抑制目的CYP基因表达的寡聚核酸分子的病毒表达载体、或一种能够表达目的CYP基因的病毒表达载体； 2)对步骤I中的病毒表达载体进行包装，获得病毒； 3)将步骤2中获得的病毒导入所述非人类哺乳动物体内； 4)检测目的CYP基因在所述非人类哺乳动物体内的表达水平。
8.权利要求1-7任一项所述的方法在制备CYP基因过表达或者表达抑制的非人类哺乳动物模型系统中的应用。
9.权利要求1-7任一项所述的方法制备的非人类哺乳动物模型系统。
10.权利要求1-7任 一项所述的方法在医学、药理学、临床前药物研究、口服药物的代谢研究、静脉注射药物的代谢研究、药品开发、实验动物模型系统制备、疾病诊断或疾病治疗方法研究中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种调控非人类哺乳动物细胞色素P450(CYP)基因表达水平的方法以及该方法在产生非人类哺乳动物模型中的应用；进一步的，本发明提供了利用该方法产生的动物模型，以及动物模型在临床前药物研究中的应用。
文档编号C12N15/11GK103243120SQ201310015230
公开日2013年8月14日 申请日期2013年1月16日 优先权日2012年2月2日
发明者杜权 申请人:北京大学